いつも拝見させていただいております。
私はヒトIgG1 Fc融合タンパク質をHEK293T細胞から分泌させています。
この血清フリーなOPTI-MEM1ベースの培養液中に分泌されたタンパク質をProtein Aセファロースを用いて精製を行なっていますが、今回はビーズに大部分が残ってしまいました。
溶出方法はpH4.0の酢酸緩衝液をはじめに試しましたが、OD280のピークは見られませんでした。他のFc融合タンパク質では分画2-3にピークが来ていました。確認のため、溶出後のビーズにSDSサンプルバッファーを加え煮沸したものもSDSPAGEのレーンの一つに流したところ、いずれも大部分がビーズに残っていました。pH3のクエン酸緩衝液で溶出をし直してみましたが、それでもピークは見られずでした。
このFc融合タンパク質はすでに別のラボで使われているもので、addgeneから入手したものになります。
現在、いつも自作しているFc融合用プラスミドにインサートを載せ替えて再度発現精製を行うつもりです。
ただ、昔大腸菌にてGST融合タンパク質を発現させた際、アグってしまったのかビーズから溶出されないことがありました。もしかしたら今回のもビーズ上でアグってしまっていないかが一抹の不安です。
このような実験を行なっておられる方がいらっしゃいましたら、対処法をご教示いただけませんでしょうか？
読みにくい文章になってしまっているかもしれませんが、どうぞよろしくお願いいたします。 |
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