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(無題) 削除/引用 No.8932-10 - 2020/07/14 (火) 19:17:21 - AA うまく行かれたとのことでおめでとうございます。 ちなみにやはりSalmon sperm DNAが悪さをしていたのでしょうか？ 何が一番改善に貢献したか、点を明確にしてもらえると後でこのスレッドを参照する人のために良いかと思います

(無題) 削除/引用 No.8932-9 - 2020/07/14 (火) 19:06:16 - きた 回答していただきありがとうございました。 DAPI染色、うまくいきました。

(無題) 削除/引用 No.8932-8 - 2020/06/18 (木) 17:51:32 - きた うに様、AA様 ありがとうございます。 Salmon sperm DNAを入れないハイブリバッファーで実験してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.8932-7 - 2020/06/18 (木) 16:30:39 - AA 私が使用しているプロトコルではDNAを使わずにtRNA(濃度500ug/ml)を使用していました。

(無題) 削除/引用 No.8932-6 - 2020/06/18 (木) 15:41:21 - うに やっぱりハイブリバッファー中のSalmon sperm DNAはアヤしくないでしょうか。ブロッキング剤として組織に吸着させてさせるのが主な目的ですし、そのために高濃度でつかっているわけで、組織はそうとうDNAで汚れていると思いますが。 ハイブリバッファーにいれるキャリア核酸は、それほど効果はないから不必要とするプロトコールもあるくらいで、省いてしまってもいけるかもしれない。あるいはRNAならそれほど染まらないはずなので、同じ目的で古くからよく使われているyeast tRNAに切り替えるとか。

(無題) 削除/引用 No.8932-5 - 2020/06/18 (木) 14:35:40 - きた AA 様 ＞マウス脳切片での話ですが、ハイブリ温度が高いISHをやるとDAPIの染色性が悪くなる経験があります。(通常の免染のようなクリアな核染色ではなく、細胞質も含めてぼやっと染まる。核が全く見えないわけではない) 70度でハイブリしていたのですが、55度で行う別の方法のときは大丈夫でした。 サンプルとしては、AA様のおっしゃるような「クリアな核染色ではなく、細胞質も含めてぼやっと染まり、核が全く見えないわけではない」という記述に近い見え方をするものもございます。 ただ、私がMergeを行いたい翅の部分（翅脈）は特に核の判別が難しく全体が強く青白く光ってしまっています。ちなみに、ハイブリ温度は57℃に設定しています。 現在のところ、ハイブリバッファーが怪しいと睨み新しく調製しようとしているところですが、原因はよく分かっておりません...

(無題) 削除/引用 No.8932-4 - 2020/06/18 (木) 10:58:19 - AA マウス脳切片での話ですが、ハイブリ温度が高いISHをやるとDAPIの染色性が悪くなる経験があります。(通常の免染のようなクリアな核染色ではなく、細胞質も含めてぼやっと染まる。核が全く見えないわけではない) 70度でハイブリしていたのですが、55度で行う別の方法のときは大丈夫でした。 (温度以外もWash bufferの組成が違ったりするのでそちらも原因かもしれませんが) 私にも原因は不明ですが、なにかの参考になれば。

(無題) 削除/引用 No.8932-3 - 2020/06/17 (水) 22:19:17 - きた うに 様 ＞DAPIなしなら起こらない現象でしょうか。 あるいはDAPI用以外のフィルターセットでも同じように光ったりしないでしょうか。 自家蛍光や散乱の可能性があると思います。 DAPIは核酸に結合しないと蛍光を発しないはずなので、核以外も光るというところがあやしい（RNAにも結合するけど波長や強度が異なるので普通は拾わないはず）。ハイブリバッファーにキャリア核酸が入っていたから？ DAPIなしの場合は起こらない現象です。他の蛍光のフィルターセットでは光らないことから自家蛍光などはありません。 ハイブリバッファは200mLの組成が以下のようになっています。 100mL Formamide 50mL 20 x SSC 2mL Salmon Sperm DNA [10mg/mL] 20mg Heparin 200µL Tween 20 48mL H₂O 10g デキストラン硫酸ナトリウム 核酸として検出されそうなのはSalmon Sperm DNAですが... ＞mRNAをチラミドシグナル増幅法によって検出する前にDAPI染色を行おうとしました。 やったことはないんだけれど、この順序はなにか意図があるんでしょうか。DAPIなんてすべての工程が終わってマウントするとき、マウント剤に入れるだけでもいいくらいなのに、なんで先にするのかな。 DAPIの染色は非可逆的でなないし（脱染色、拡散しうる）、過酸化水素を加えたラジカル反応に耐えるのでしょうかね。 TSA→DAPI染色という手順でやってみても、DAPI染色→TSAという手順でやってみても翅全体が青白く光ってしまうという状態は変わりませんでした。プロトコルとしてはどちらの順序のものも存在しているようでして、絶対にこの順序でなければならないというわけではないようです。

(無題) 削除/引用 No.8932-2 - 2020/06/17 (水) 18:40:28 - うに >標的mRNAが核内に存在することを示すために、DAPIを用いて核染色をしようとしているのですがうまくいきません。翅全体が青白く染まってしまい、核以外の部分も光ってしまっているようです。 DAPIなしなら起こらない現象でしょうか。 あるいはDAPI用以外のフィルターセットでも同じように光ったりしないでしょうか。 自家蛍光や散乱の可能性があると思います。 DAPIは核酸に結合しないと蛍光を発しないはずなので、核以外も光るというところがあやしい（RNAにも結合するけど波長や強度が異なるので普通は拾わないはず）。ハイブリバッファーにキャリア核酸が入っていたから？ >mRNAをチラミドシグナル増幅法によって検出する前にDAPI染色を行おうとしました。 やったことはないんだけれど、この順序はなにか意図があるんでしょうか。DAPIなんてすべての工程が終わってマウントするとき、マウント剤に入れるだけでもいいくらいなのに、なんで先にするのかな。 DAPIの染色は非可逆的でなないし（脱染色、拡散しうる）、過酸化水素を加えたラジカル反応に耐えるのでしょうかね。

in situ hybridizationで、DAPI染色がうまくいかない 削除/引用 No.8932-1 - 2020/06/17 (水) 16:44:26 - きた 初めて投稿させていただきました。 蛹化後35h前後のショウジョウバエの蛹の翅をサンプルに、in situ hybridizationの実験を行っている者です。 標的mRNAが核内に存在することを示すために、DAPIを用いて核染色をしようとしているのですがうまくいきません。翅全体が青白く染まってしまい、核以外の部分も光ってしまっているようです。 mRNAをチラミドシグナル増幅法によって検出する前にDAPI染色を行おうとしました。DAPIを濃度が1µg/mLになるようにPBTに溶かし5min反応させています。in situ hybridizationではなく、タンパク質の抗体染色のみを行う場合は、同じ濃度・条件で２次抗体結合後のDAPI染色は成功しています。 核染色を成功させるためにどのような点を改善すれば良いでしょうか？翅全体が青白くなってしまう理由もよく理解していないので、教えていただけると大変ありがたいです。 ご回答よろしくお願い致します。 きた

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