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(無題) 削除/引用 No.8965-4 - 2020/06/28 (日) 11:52:52 - rt 774Rさん、レスありがとうございます。 やっぱりそう考えるのが自然なのかもしれないですね。実は私もそうなのかなと薄々思っていたのですが、一応特異的なプライマーで、他の系ではtotal RNAを使ったRT-PCRでワークしていることもあり、そこまで強い競合が発生し得るのだろうか？とも思えていたものの、実際そうとしか考えられない現象が起こっているので、発生し得ると考えるのが普通といえそうです。 ちょっとプライマーを変えてチャレンジしてみます。 しょうもない質問にお付き合いいただきどうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.8965-3 - 2020/06/28 (日) 08:50:19 - 774R 標的の遺伝子の発現量が低いということを前提に、実はRT-PCRでは検出限界以下だと仮定して考えてみます。 次に、RT(-)で出現するバンドは残存ゲノム由来だとします。 これがRT(+)で消失する理由についてですが、逆転写により当然様々なcDNAが合成されます。これらはノンスぺのPCR産物の鋳型となります。PCR産物の増幅はある意味競合的な関係があるので、ノンスぺのスメア産物によりRT(-)で見られたバンドが増えにくくなったと考えるのはどうでよう？

(無題) 削除/引用 No.8965-2 - 2020/06/28 (日) 06:05:50 - rt あ、書き忘れてましたが、コントロールのGAPDHは、完璧な結果でした（RNA量に応じた綺麗な単一PCRバンドが得られた）。 よって反応自体は問題ないと思うのですが、標的の遺伝子は、発現量が小さいこともあって、PCR 30サイクルでRT+/-とも何も増えない→38サイクルで、前述のRT(-)のみに標的遺伝子っぽいサイズの単一バンド・RT(+)はしょうもないパターン…という感じでした。 何か陥りがちなポイント等ありましたらよろしくお願いします。

RT(-)で増えて、RT(+)で増えない逆転写PCR 削除/引用 No.8965-1 - 2020/06/28 (日) 01:32:07 - rt 表題の通りなんですが、qPCRではなく、古典的な逆転写PCRを行っています。 RT(-)サンプルからは標的サイズと思われるバンドが増幅してきたのですが、RT(+)サンプルはハッキリしたバンドがなく、なんとなくスメアになっている（そこまで多量の増幅スメアがあるわけでもなく、中途半端に薄いバンドが点在するような、ダメなPCR結果のような感じ）状況です。 違いは逆転写酵素の有無のみであり、RT(-)で残存ゲノムDNA由来のものが増えるのならRT(+)サンプルでも増えてしかるべきに思うのですが、このような結果は実は何度か経験しています。 これはよくあることなのか、あるのならどういった理由付けができて対処法には何か有効なことがあるのか、ご存知の方がいらっしゃいましたらアドバイスいただけると大変ありがたく思います。

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