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レンチウイルスのタイターは気にするべきでしょうか トピック削除
No.9002-TOPIC - 2020/07/10 (金) 07:32:20 - レンチウイルス
質問させてください。
レンチウイルスを使って遺伝子を発現させたいのですが、pLentiベクターに目的の遺伝子を載せ、ウイルスを作製し、標的細胞にそのウイルスを加えた際、1細胞あたりに2つ以上感染させないように配慮はするべきなのでしょうか？

例えば6ウェルディッシュに標的細胞をまき、異なる量のウイルス液を加え、ピューロマイシンできちんとごっそり死んだウェルから細胞を樹立するべきでしょうか？それとも、そんなことは気にせず、ウイルス液の原液を加え、ピューロでどの細胞もまるで死んではいないような感染様式でも構わないでしょうか？

私の目的はある遺伝子を、そのタンパク質が発現していない細胞に発現させることです。
大変初歩的なことだとは存じますが、使用しているベクターのデータシートには特にそのような記載がありませんでしたので、ここで質問させていただきました。
よろしくお願いいたします。
　
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No.9002-6 - 2020/07/11 (土) 04:15:44 - レンチウイルス
a様、M様、
ありがとうございます。
心に留めます。

(無題) 削除/引用
No.9002-5 - 2020/07/10 (金) 15:32:19 - M
実験目的によると思います。

発現レベルを生理的な範囲内でコントロールしたい場合は、インテグレートするコピー数は少ない方が良いと思います。ランダムインテグレーションによる影響を最低限にする意味でも、１コピーに抑えた方が良いかもしれません。

目的タンパクの発現が大過剰でも良くて、感染後可及的早期に実験を開始したい（発現の長期化による表現形の変化が実験に影響する場合など）時などは、原液で100%感染（薬剤選択なしで実験に入る）でも良いと思います。

とりあえず、スモールスケールでMOIを振ってみる事をオススメします。原液でも100%入るとは限らないですし。

(無題) 削除/引用
No.9002-4 - 2020/07/10 (金) 15:20:39 - a
なんらかの目的で「1細胞あたりに2つ以上感染させないようにする」という手段はとることはありうるかもしれません。具体的には multiplicity of infection (MOI) を 1 未満にするなどの方法になるかと思いますが。

たとえば、レンチウイルス法を用いた造血幹細胞の遺伝子治療をする際には、安全性などを考えて導入遺伝子の影響を最小限に抑えるため、細胞1ヶあたりの組込み数を減らすように条件検討するかと思います。

現在のご自身の研究の目的からして、合理的な手段でなければそれに従う必要はないかと思います。

(無題) 削除/引用
No.9002-3 - 2020/07/10 (金) 12:21:45 - レンチウイルス
おお様

＞1細胞あたりに2コピーじゃだめなんですか？

必要以上にゲノムへのintergrationをさせないためにも1コピーでなくてはいけないのではないか、と思いトピックを立てさせていただきましたが、一般論としてお聞きしたかったので答えをいただけました。

ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.9002-2 - 2020/07/10 (金) 10:48:36 - おお
1細胞あたりに2コピーじゃだめなんですか？

https://www.genecopoeia.com/resource/lentivirus-thats-my-moi-and-im-sticking-to-it-lentivirus-moi-cell-lines/

パッケイジングされた Lentivirus vectorを売っている会社の大抵が１から１０MOIで最適な量をさぐれと書いています。上記のURLでは物によっては１００ぐらい使わないとだめみたいなものあるみたいです。

たとえばEGFPなどを発現するLentivirus vectorでほぼ１００％の導入効率を理想的として示している図はよく見ます。

細胞に入るコピー数ですが、例えば単に薬剤耐性のプラスミドをTransfectionして薬剤耐性の株を拾ってきたとき、よく入る細胞では１００コピーほとIntegrateされていると言われているようです。

これがいいですかとか言われると、薬剤選択でほぼ全部生き残るような状況でも大抵はいいと思います。

ただし一般論です。

レンチウイルスのタイターは気にするべきでしょうか 削除/引用
No.9002-1 - 2020/07/10 (金) 07:32:20 - レンチウイルス
質問させてください。
レンチウイルスを使って遺伝子を発現させたいのですが、pLentiベクターに目的の遺伝子を載せ、ウイルスを作製し、標的細胞にそのウイルスを加えた際、1細胞あたりに2つ以上感染させないように配慮はするべきなのでしょうか？

例えば6ウェルディッシュに標的細胞をまき、異なる量のウイルス液を加え、ピューロマイシンできちんとごっそり死んだウェルから細胞を樹立するべきでしょうか？それとも、そんなことは気にせず、ウイルス液の原液を加え、ピューロでどの細胞もまるで死んではいないような感染様式でも構わないでしょうか？

私の目的はある遺伝子を、そのタンパク質が発現していない細胞に発現させることです。
大変初歩的なことだとは存じますが、使用しているベクターのデータシートには特にそのような記載がありませんでしたので、ここで質問させていただきました。
よろしくお願いいたします。
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