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分泌阻害をかけたらどうですか？ 削除/引用 No.9011-7 - 2020/07/31 (金) 14:43:29 - みみ ゴルジ依存の分泌に限りますが、分泌量解析だけなら、 12時間ぐらい分泌阻害をかけて、FACSがWBで比べるといいと思います。 分泌されたものの構造とかなら別ですが。 モノが欲しいなら、無血清培地の培養後にIPが適当かと思います。

(無題) 削除/引用 No.9011-6 - 2020/07/15 (水) 06:18:10 - mp stratacleanレジンを使って濃縮してます。本来核酸溶液中のタンパク除去に使うものですが、逆に濃縮にも使えます。ただしアルブミンも大量に濃縮されてきますので、極力血清はのぞいておいた方がいいです。

(無題) 削除/引用 No.9011-5 - 2020/07/15 (水) 05:02:35 - れんちん 私なら無血清培地を使います。 そのまま流すのも濃縮も無血清培地なら問題ありません。 通常のFBS入りだと、私の経験ではそのまま流すのも濃縮もうまくいかないことの方が多い印象です。もちろん無血清培地でその分泌が影響されるかは検討が必要ですが。

(無題) 削除/引用 No.9011-4 - 2020/07/15 (水) 03:56:23 - 後藤 >[Re:1] 勉強中さんは書きました : > みなさま > > ふと思ったことなのですが、培養細胞を使って > 一般に分泌タンパク質をWBでみたい時はどうしているのでしょうか？ > > 培地中に拡散してしまっているため、 > 培地にそのままSDSを入れてサンプル化するのは現実的ではないように感じました。 > まんま流しちゃうか、フィルターで濃縮して流すか、あるいはWBしないでELISAしちゃいますね。

(無題) 削除/引用 No.9011-3 - 2020/07/15 (水) 01:20:07 - おお >[Re:1] 勉強中さんは書きました : > > 培地中に拡散してしまっているため、 > 培地にそのままSDSを入れてサンプル化するのは現実的ではないように感じました。 それで検出できる蛋白もまあまああります。ただ培養に血清を使っているなら相当量のBSAが入っていますから流せる容量は限られてきます。そういう場合は濃縮すると目も当てられません。 免疫沈降もやれる一つの方法かもしれません。ただし培地に血清が入っているなら、Protein A/Gビーズで血清中の抗体を回収してからにしたほうがよさそうです。 ＞超遠心で濃縮する？ 出来るんですか？

(無題) 削除/引用 No.9011-2 - 2020/07/14 (火) 16:40:28 - vcgh+n 低吸着遠心フィルターユニット（MW3000でカットのやつ）を使って10〜20倍まで濃縮してます。WBならスモールスケールでいいともうので、2mlのCM→100μlくらいとしてだいたい１時間くらいで濃縮できます。濃縮せずに検出できればそれに越したことないですが増殖因子とかだとたいてい微量なので濃縮しないと薄すぎて検出が難しいです。今は遠心フィルターユニットそんな高くないです。昔、近くの年寄りに、高いし、タンパク質が吸着してなくなるからからあれは全然　亜qw瀬drftgy不二lp；だとか言われましたが、今まで調べた限りのどのタンパク質もいい感じで回収できています。 吸着等のロスが気になるようでしたら手間と時間がかかりますが、80%飽和硫安で一晩かけて沈殿させて少量のbufferに溶解してから透析という方法もあります。酵素や増殖因子の活性も維持されます。

分泌タンパク質のWB 削除/引用 No.9011-1 - 2020/07/14 (火) 14:40:10 - 勉強中 みなさま ふと思ったことなのですが、培養細胞を使って 一般に分泌タンパク質をWBでみたい時はどうしているのでしょうか？ 培地中に拡散してしまっているため、 培地にそのままSDSを入れてサンプル化するのは現実的ではないように感じました。 TCAで落としてくる？ 超遠心で濃縮する？ どんな方法が一般的かつ簡易的なのでしょう？ お手隙の際にお答えくださると助かります。

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