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Cre/loxPを用いたダブルコンディションノックアウトについて トピック削除
No.9074-TOPIC - 2020/08/12 (水) 04:11:55 - うっちー
表題の通り、Cre/loxPシステムにより、Osteocalcin-Creマウスを用いて、骨芽細胞特異的に二つの遺伝子（遺伝子A、遺伝子B）をノックアウトしたマウスを作成しています。

遺伝子Aをコンディションノックアウトした場合の表現型は野生型と変わりません。一方で、遺伝子Bのみをコンディショナルノックアウトしたマウスは、非常に小さくなる表現型を認めています。

しかしながら、遺伝子Aと遺伝子Bの双方をコンディションノックアウトしたダブルcKOマウスは、体格が小さいものや、大きいものがランダムに現れます。
この原因がわからず、困っております。

以前に、2種類の遺伝子に対するloxP配列を認識する場合、うまくCreが作用しないことがあるという話を聞いたことがあるのですが、詳細を理解しておりません。この点について、ご教示頂けますと幸いです。基礎知識が不足していることは承知しておりますので、参考資料なども教えて頂けますと助かります。
よろしくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.9074-5 - 2020/08/12 (水) 11:09:33 - うっちー
留学徒様

明快なアドバイス、有難うございます。
確かにその通りですね。ノックアウト効率を確認したうえ、恣意的にサンプルを選択することになった場合には、論文投稿時にも明記するようにいたします。アドバイス、有難うございました。

(無題) 削除/引用
No.9074-4 - 2020/08/12 (水) 08:05:42 - 留学徒
> このようなケースでは、ノックアウト効率が高く、表現型がはっきり表れているサンプルを意図的にピックアップしないと、メカニズムの解析が難しいと考えているのですが、いかがでしょうか

そのように明記をしたらよいかと思います。
私の表現型解析に用いているマウスも2割ほどのKOマウスでしか表現型は認められません。
そのため恣意的にその個体を選び、そのマウスから得られたサンプルのみでデータ解析をしています。
論文にはそのように明記しています。

(無題) 削除/引用
No.9074-3 - 2020/08/12 (水) 07:11:46 - うっちー
M様

早速のアドバイス、有難うございます。
仰られる可能性が高いと思います。
まずは、免疫染色でそれぞれのcKOマウスにおける、遺伝子Aと遺伝子Aのノックアウト効率を確認しようと思います。
また、骨芽細胞の分離も可能かと思いますが、その場合は、遺伝子Aと遺伝子BのmRNAの発現を調べれば良いでしょうか？


今回、遺伝子Aと遺伝子Bの骨格成長における役割について研究を行っています。今後、メカニズムの検討を行う予定なのですが、ノックアウト効率が高いサンプルを中心に、作為的にピックアップして解析を行うのは、問題がありますでしょうか？

医学研究の基本として、サンプルはランダムに選択し、再現性を担保することが大切だと思うのですが、このようなケースでは、ノックアウト効率が高く、表現型がはっきり表れているサンプルを意図的にピックアップしないと、メカニズムの解析が難しいと考えているのですが、いかがでしょうか・・・。
初歩的な質問で恐縮ですが、アドバイスを頂ければ幸いです。

(無題) 削除/引用
No.9074-2 - 2020/08/12 (水) 06:06:04 - M
遺伝子Bのノックアウトによる表現形が、遺伝子Aのノックアウトにより相殺される可能性を考えます。例えば、Creに対する感受性が遺伝子AとBで異なり、遺伝子Aのノックアウト効率が悪ければ、遺伝子Bの表現形が相殺されるマウスと、そのまま表現形を維持するマウスに分かれる可能性があります。遺伝子Aのノックアウト自体は表現形がないとの事なので、シングルでの遺伝子Aのノックアウト効率は表現形では判断できないですよね。

遺伝子Aのシングルノックアウト及び遺伝子Bとのダブルノックアウトから骨芽細胞を分離してノックアウト効率を見れば分かると思いますが、どうでしょうか？　骨芽細胞については分離も培養もした事がないのですが、もし技術的に分離が困難であれば、他の方法（免疫組織染色など）でも良いので、評価してはいかがでしょう？

Cre/loxPを用いたダブルコンディションノックアウトについて 削除/引用
No.9074-1 - 2020/08/12 (水) 04:11:55 - うっちー
表題の通り、Cre/loxPシステムにより、Osteocalcin-Creマウスを用いて、骨芽細胞特異的に二つの遺伝子（遺伝子A、遺伝子B）をノックアウトしたマウスを作成しています。

遺伝子Aをコンディションノックアウトした場合の表現型は野生型と変わりません。一方で、遺伝子Bのみをコンディショナルノックアウトしたマウスは、非常に小さくなる表現型を認めています。

しかしながら、遺伝子Aと遺伝子Bの双方をコンディションノックアウトしたダブルcKOマウスは、体格が小さいものや、大きいものがランダムに現れます。
この原因がわからず、困っております。

以前に、2種類の遺伝子に対するloxP配列を認識する場合、うまくCreが作用しないことがあるという話を聞いたことがあるのですが、詳細を理解しておりません。この点について、ご教示頂けますと幸いです。基礎知識が不足していることは承知しておりますので、参考資料なども教えて頂けますと助かります。
よろしくお願いいたします。
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