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(無題) 削除/引用 No.909-9 - 2012/09/12 (水) 04:04:03 - おお >[Re:8] JyunYaさんは書きました : > 皆様のECL比較は大変参考になります。ここでの比較は抗体濃度が同じ場合（同じ実験ステップで、最後に振り掛ける化学発光試薬が違う）ですよね？ 感度のよいキットではバックグランドが高くなるので抗体量を減らすことが多いです。それでも明らかな感度の高さがかんじられます。 > > >[Re:1] おおさんは書きました : > > これらECLでシグナルが強すぎてコントロールしにくい時はどうしますか? > > 抗体の濃度を変える（下げる）のがファーストチョイスですねー。その前に露光時間を短くすることは試すでしょうが。 > ありがとうございました。時間はたまに0.5秒とか、てでコントロールできないほど短いコンタクトをしないと適切なバンドの強度が調整できないことがありますね。そうするとなんか同じような超短いコンタクトをして、偶然でいろいろな強度のバンドをえるということになったりします。 > > 　低濃度抗体では標的タンパク質（エピトープ）の全てに抗体が結合していないのが原因ですか？（抗体の絶対数が足りないand/or時間が短い　よって衝突（認識）の確率が低いから？）（PVDF膜に疎水的吸着したタンパク質が、抗体処理時間と共に形を変えたり向きを変えたりして、結果として立体障害が解消されることで抗体結合量が増えるなんて事はありえるのか？吸着も平衡だから有り得るのか？） K = [Ab–Lg]/[Ab] [Lg] 構造的なものもあると思いますが、上記の式である程度納得が行きませんか?ちょと現実的な数字での計算はしてませんけど。 > > > 　質問が変わりますが、近年はいろいろなメーカーが高感度の化学発光試薬を発売していますが（競っているようにも思われますが）、どのような人が使うのですか？それだけ発現量が少ない標的タンパク質が研究対象になっているという事でしょうか？感度もいいらしいが値段もかなり高いのが気になり発言しました。ちょっとだけ愚痴です。 例えばマンマルの細胞からタンパクを抽出してきて、WBした場合で、あるたんぱく質が各細胞に1分子発現してるとすると、１レーンに流せる標的タンパクは0.01pg程度ですね(かなりラフな計算です)。100分子あれば1pgです。 また組織を研究材料につかうと、調べたいたんぱく質を発現しているたんぱく質は全体の細胞のポピュレーションのごく一部だったりします。 くわえてそれぞれの抗体はやはりあふぃにティに大きな開きがありますから、検出感度は100倍とか抗体によって開きがあっても驚きません。 そんな所も高感度の物を使う理由なんではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.909-8 - 2012/09/12 (水) 00:52:13 - JyunYa 皆様のECL比較は大変参考になります。ここでの比較は抗体濃度が同じ場合（同じ実験ステップで、最後に振り掛ける化学発光試薬が違う）ですよね？ >[Re:1] おおさんは書きました : > これらECLでシグナルが強すぎてコントロールしにくい時はどうしますか? 抗体の濃度を変える（下げる）のがファーストチョイスですねー。その前に露光時間を短くすることは試すでしょうが。 　ところで、抗体濃度を上げるとシグナルは上がりますよね（ノイズも上がりますが）。それって何で？というのが質問です。 　低濃度抗体では標的タンパク質（エピトープ）の全てに抗体が結合していないのが原因ですか？（抗体の絶対数が足りないand/or時間が短い　よって衝突（認識）の確率が低いから？）（PVDF膜に疎水的吸着したタンパク質が、抗体処理時間と共に形を変えたり向きを変えたりして、結果として立体障害が解消されることで抗体結合量が増えるなんて事はありえるのか？吸着も平衡だから有り得るのか？） 　質問が変わりますが、近年はいろいろなメーカーが高感度の化学発光試薬を発売していますが（競っているようにも思われますが）、どのような人が使うのですか？それだけ発現量が少ない標的タンパク質が研究対象になっているという事でしょうか？感度もいいらしいが値段もかなり高いのが気になり発言しました。ちょっとだけ愚痴です。

(無題) 削除/引用 No.909-7 - 2012/09/08 (土) 20:38:34 - Gum フィルムをお使いなら、シグナルが強すぎる時は2枚重ねにして現像するとちょうど良くなることがありますね。 actinなどシグナルが強い蛋白は高感度ECLを使わないようにしています。2次抗体は25000倍くらいまで希釈して、通常のECLで検出しています。

(無題) 削除/引用 No.909-6 - 2012/09/08 (土) 06:32:32 - おお >[Re:4] nanashiさんは書きました : >[Re:3] カイさんは書きました : ありがとうございました。こういう感触とかインフォメーションがあるとたいへん助かります。

追伸 削除/引用 No.909-5 - 2012/09/08 (土) 04:58:02 - nanashi 追 909-4で "=regular ECL" と書いたのはPicoの感度がregular ECLと大差なかったという意味です。 念のためです・・・。 Picoのいいところ書けなくてThermoさんすいません（笑）。

(無題) 削除/引用 No.909-4 - 2012/09/08 (土) 04:54:00 - nanashi 私もPrime >>> Pico (=regular ECL)と感じました。 Picoは価格が魅力的ですが、メーカーが言うほど高感度とは思いませんでした・・・。 FemtoはPrimeと同等の感度だった印象です。 MilliporeのLuminata Forteは比較的安く、感度もPrimeと同等または若干劣る程度と十分です。Premixで常温保存可能なため使いやすいですね。

(無題) 削除/引用 No.909-3 - 2012/09/08 (土) 03:32:57 - カイ SuperSignal West PicoとECL primeを比較しました。 ECL primeのほうが格段に感度がいいですね。 West Picoで出ないバンドがECL primeでは出る、というか。正確に定量したわけではないですが軽く5倍は感度が違う印象です。 ただ、強すぎて全体的にバックグラウンドが高くもなりやすいです。 内在性の発現量が少ない等、出にくいたんぱく質なら時々ECL primeがほしくなりますね。ただ高いですし。 結局普段使っているECLの感度にあわせて、のせるタンパク量、使う一次抗体量、露光の長さで調節しています。 SuperSignal Femtの方が感度がいいと聞きましたが私自身は試したことがないです。どなたか使った方がおられましたら便乗でお聞きしたいです。

(無題) 削除/引用 No.909-2 - 2012/09/07 (金) 14:05:53 - おお いろいろかきましたが、ECLの最近の情報、思う事など何でも気軽に書いていただくとうれしいです。

ECLの感度や組成 削除/引用 No.909-1 - 2012/09/07 (金) 13:48:12 - おお 4-iodophenylboronic acid ECLで4-iodophenylboronic acidを使ったキットはありますか。 またSuperSignal West Pico (Thermo-fisher), ECLplus (PS-3 base, GE(terminated) or Thermo-fisher), ECLprime(GE)を比較したことがありますか。SuperSignal West Pico, ECLprimeの主要成分はなにですか? これらECLでシグナルが強すぎてコントロールしにくい時はどうしますか? PSー3ベースのものは最終プロダクトが蛍光物質なので傾向ではかれるとありますが、luminolのプロダクトや、そのたの基質の最終プロダクトに同じ傾向はないのでしょうか。 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022175906002948

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