BioTechnicalフォーラム [realtime PCRの再現性]

realtime PCRの再現性

No.91-TOPIC - 2012/01/27 (金) 00:32:15 - ＰＣＲ

どうかお力をお貸しください。
現在微量の細胞からrealtime PCRを
行っています。逆転写するときの濃度は
約200ngです。これを逆転写後、
3倍に希釈し、10μｌの系で
反応をかけています。

問題なのは再現性です。
ピペッティングも念入りに行い、
Master Mixもプライマー以外は
すべて混ぜ、２等分して、
片方は内部標準、片方は標的遺伝子の
プライマーを加えています。
しかし同じサンプルで再試すると、
ぶれてしまうのです。

良い改善法がありましたら、
是非教えていただきたく思います。
どうぞよろしくお願いいたします。
　

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No.91-8 - 2012/01/28 (土) 15:01:52 - 。。。

qPCRの反応液量は、機器によって異なります。

Applied Biosystemsの機械だと、
３８４穴プレートタイプの7900などでは5ul、
９６穴の 0.1ml プレートタイプの7500FASTなどでは10ul、

いわゆる普通のPCRプレートの大きさの
９６穴の 0.2ml プレートタイプを使う7500などでは20ul、
が最低必要液量になっています。

ですので、
使っている機器とPCRプレートの組み合わせが、
10ulでちゃんと読めるのかどうかが問題なのでしょう。

取扱説明書に書かれていると思います。

(無題)

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No.91-7 - 2012/01/28 (土) 14:42:00 - KY

逆転写のRNA濃度は0.5～2ug/20ulの反応系で逆転写反応してます。
0.5でも2でもそれほど大きな違いはないように思います。これを5倍希釈して、2ulをreal-time PCRで使用してます(20ulの反応系)。

RNA自体が薄くても、目的遺伝子が十分発現していれば問題ないと思います。

(無題)

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No.91-6 - 2012/01/28 (土) 07:35:50 - 初心者

非常に参考になります。逆転写するときのＲＮＡ濃度はどうされているのでしょうか？
薄すぎることも一因として考えられるでしょうか？

(無題)

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No.91-5 - 2012/01/27 (金) 19:05:55 - KY

Realtime PCRの一般的な反応量は40～50ulと一般的に書かれています。
私のラボでは試薬をケチるために20ulにしてますが、少なくすればするほど操作上ある程度の誤差が出やすくなると聞きました。

また逆に考えると、もし10ulでＯＫなのであれば、なぜ5ulやもっと少ない量ではいかないのかということにもなります。（もちろん20ulならＯＫという決まりも私は知りません）。

またそもそもRealtimeはある程度ブレるものなので、同じサンプルを3つ同時に測定し、その平均値を使用することは必要であるとも思います。（Nは1ということになります）

ちなみに増幅効率とは、ちゃんと1cycleごとに2倍になっているかとどうかということです。メルティングカーブがきれいなことは前提条件です。濃度存知のプラスミドや、濃度の高いサンプルを使用して、検量線を引けば分かるはずです。これが少なくとも80%以下では悪いプライマーとなると考えられています。

(無題)

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No.91-4 - 2012/01/27 (金) 14:57:23 - 初心者

ご返信ありがとうございます。
Ct値は25前後、
Melting curveはきれいに出ます。

4の20μlの系というのは、
cDNAの濃度も２倍にして、
ピペッティング時のブレを
抑えようということでしょうか？

ぶれるのは両方です。

(無題)

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No.91-3 - 2012/01/27 (金) 13:55:17 - KY

１、増幅効率がよいプライマーか。
２、CT値は30台後半だと、ぶれるのはしょうがない。
３、機械のWellが汚れている。
４、より多いvolume、20ul以上で行う。

ちなみにぶれるのは内部標準と標的の両方なんでしょうか？

(無題)

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No.91-2 - 2012/01/27 (金) 08:26:33 - Harmonia

ぶれるって言われてもねぇ。

まずはがんばるしかないですね。