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不安定な結果がある実験のデータの再現性について トピック削除
No.9104-TOPIC - 2020/08/26 (水) 02:58:11 - メンタルmax
お世話になっております。初心者です。細胞株を用いたアッセイで、ある遺伝子を導入した群とコントロール群の2群間で比較しております。何度か試験した所、増加、減少、変化なしはありましたが減少するという結果でp<0.05となり、実験終了しました。恐らく何度か追試しても平均では減少という結果にはなると思います。最後の試験の結果がやや増加してしまい不安になっております。どこかで区切りをつけるべきとは思いますが、論文が世に出た後、他の研究者より逆の結果だとクレームがあったらどうしようなど不安に思っております。こういったご経験はありますでしょうか?中々、相談できる人がいないためご相談させて頂きました。よろしくお願いいたします。
 
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(無題) 削除/引用
No.9104-12 - 2020/08/26 (水) 19:30:35 - メンタルmax
皆さま貴重なご意見を頂きすいません、お返事少しお時間頂けますと幸いです。どうぞよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用
No.9104-11 - 2020/08/26 (水) 17:16:54 - bn
すみません。せっかくご説明いただいてあれなのですが、うちらのような平凡な研究者には文章が難しくてさらにわからなくなりました。私なりに頑張って解読してみたのでこれでいいかどうかご確認ください。(``割``が曖昧で、場所によっていろんな意味で使ってるようでそれが混在しているように思います)

``減少:多いので9割``=何度か繰り返し実験を繰り返す中で、もっとも減少したものは相対値として対照群の値1に対して実験群の値が0.1

``平均して2割``=何度か繰り返し実験を繰り返した結果、平均すると相対値として対照群の値1に対して実験群0.8

``増加:多くて2割``=実験回によっては時には対照群1に対して実験群 1.2 くらいの増加のこともあったが、平均すると大体対照群1に対して実験群1.1くらいの増加

``27中、6割減少で、1割増加``=実験を独立に27回やって、27x0.6=16.2回=16回は減少するという結果だった。(11回は増加または変化なしという結果だった) ただ、減少という結果を得た実験でも相対値として対照群1に対して実験群0.8くらいだった。

もしこんな感じで正しいければ、対照群と実験群には実際にはほとんど差異はなくて、試行回数を延々増やし続けた結果、たまたまどちらかに大きく振れた回も少ないながらあってそれに引っ張られてたまたま有意差ありになったという感じがして、そこのと自体に論文で議論するような生物学的な意味があるのかどうか考えると???+?と思いました。

``遺伝子を導入した群``とありますが、これはステーブルセルでやってるのですか、それとも実験ごとにその都度細胞にトランスフェクションしてトランジエントに発現させてるのですか。後者ならば、導入効率とか発現レベルの時間的な増減とか、毎回の実験条件を厳密にコントロールするのを困難にする要因が根底にあるような気がししますので実験系のデザインから全面的に再検討することが望ましいと思います。。

(無題) 削除/引用
No.9104-10 - 2020/08/26 (水) 16:53:32 - おお
>[Re:1] メンタルmaxさんは書きました :
> お世話になっております。初心者です。細胞株を用いたアッセイで、ある遺伝子を導入した群とコントロール群の2群間で比較しております。

導入効率とターゲットの遺伝子の動きに相関性が見られるか見てみたらいいと思いますが、サンプルが残ってないでしょうか?それならある程度の以上の導入効率のものだけを使うという手はあり得ると思います。

qPCRですよね。ちゃんとRNA取れてるかなっていうのも不安要素ではあります。Internal controlのCt値や、遺伝子を導入しないサンプルにおいてのターゲットのCt値などどの程度のばらつきがありますか?

遺伝子導入は単一の細胞株ですよね。27種類の細胞株ということではないですよね。

RNAでよくつまずくのは分解してしまっていて正確に測れていないということが挙げられます。
ノーザンブロットが主体だったときはrRNAを見て28sのしぐなるが18sのシグナルのほぼ2倍で揃ってなければ実験として成り立たないと見られていました。いまのそうじゃないとデーターは信用できないと思いますが、キットでRNAとってなにもかくにんしないままRTしちゃう困ったやり方も増えてしまっているような気がします。

(無題) 削除/引用
No.9104-9 - 2020/08/26 (水) 16:31:04 - おお
>[Re:8] おおさんは書きました :
> >[Re:6] メンタルmaxさんは書きました :
> > 失礼しました。結果の記載を誤り、増加と減少は逆でした。
> >
> > 減少:多いので9割でほぼ2割
> > 増加:多くて2割でほぼ1割以内。
> > 27中、6割が減少で、平均で1割減少でした。
> >
> ごめんなさい。意味がわからない。多いので9割って、コントロールの10分の1という事かな、それで平均でコントロールの8がけってこと?
> 27中、6割が減少ってことは4割がネガティブデーターですか?

ちょっと思ったのですが、その9割減のデーターはoutlier testで有意な外れ値になってしまって、外れ値を除いて統計処理したら有意差がなくなるってことはないですか?

ちなみにoutlier testによる除外はPublishするデーターでよほどのことがない限り使わないでください。

(無題) 削除/引用
No.9104-8 - 2020/08/26 (水) 15:21:39 - おお
>[Re:6] メンタルmaxさんは書きました :
> 失礼しました。結果の記載を誤り、増加と減少は逆でした。
>
> 減少:多いので9割でほぼ2割
> 増加:多くて2割でほぼ1割以内。
> 27中、6割が減少で、平均で1割減少でした。
>
ごめんなさい。意味がわからない。多いので9割って、コントロールの10分の1という事かな、それで平均でコントロールの8がけってこと?
27中、6割が減少ってことは4割がネガティブデーターですか?

どんな実験なのかによるかもしれませんが、仮にそれがちゃんとした実験結果であっても、そのばらつく要因はレフェリーに突っ込まれると思います。まあズルはしてないと思いますが、それだけ数やるってことはそうであってほしいという心理も働いてそのために若干減少が上回ったような気がしないでもない。そういう意味でもばらつく要因は(特に手技以外で)、考察をしないと行けないと思います。あと、そのデーターをサポートするような他のデーターはどの程度ありますか?

条件検討や変更して改善しようとはしなかったのですか?

(無題) 削除/引用
No.9104-7 - 2020/08/26 (水) 14:32:18 - くも
臨床検体を扱うと過剰発現と発現消失に二極化することがよくありますが(例えとして遺伝子発現の例を挙げます)、cell lineを扱った実験だと、そこまで大きなばらつきはないはずです。N数を増やすことが必要でしょうね。

やっているうちに見えてくるものがあります。

(無題) 削除/引用
No.9104-6 - 2020/08/26 (水) 13:16:03 - メンタルmax
失礼しました。結果の記載を誤り、増加と減少は逆でした。

減少:多いので9割でほぼ2割
増加:多くて2割でほぼ1割以内。
27中、6割が減少で、平均で1割減少でした。

>bnさん
ありがとうございます。やるたびに、です。
だいたい2割増減あたりで動いている印象です。

(無題) 削除/引用
No.9104-5 - 2020/08/26 (水) 13:01:47 - bn
何回か同じ実験をして、やるたびに増加したこともあるし、変化なしのときもあるし、減少したこともあるが、その中では減少という結果が多かったという理解でよろしいでしょうか。それとも1回の実験の中で数wellなりdishを使った時、同じ処理をしたあるwell/dishでは増加していたけど、別のwell/dishでは減少していて(サンプル間のばらつきが大きい)、でも平均をとってみたら比較すると、有意に減少という結論になったということでしょうか。
2者は別の話になるのですが、質問はこの点が曖昧なので明確にしていただければと思います。

増減が変わるという対照群との差異はどのくらいなのでしょうか。たとえば1.2倍の違いと3倍では話が変わってきて、前者ですと、ちょっとした手技的なことでも動いてしまい安定した結果を得るのはかなり難しいですが、後者ですと材料や実験系自体に何か系統的な大きな問題がある可能性があるので。

(無題) 削除/引用
No.9104-4 - 2020/08/26 (水) 12:58:27 - メンタルmax
>Mさん
ありがとうございます。一度条件検討を見直してみますが、今までかなりの試行をしており、困難であればグラフの表示をご教示頂いたようにしたいと思います。

>おおさん
ありがとうございます。結果はネガティブデータも含め全て載せております。N数は27くらいで、増加は多いので9割でほぼ2割、減少は多くて2割でほぼ1割以内す。6割が増加で、平均で1割増加となりました。

(無題) 削除/引用
No.9104-3 - 2020/08/26 (水) 08:19:32 - おお
>[Re:1] メンタルmaxさんは書きました :
> お世話になっております。初心者です。細胞株を用いたアッセイで、ある遺伝子を導入した群とコントロール群の2群間で比較しております。何度か試験した所、増加、減少、変化なしはありましたが減少するという結果でp<0.05となり、実験終了しました。

増加したものがあればそんなにNを増やさない実験では有意差がつかないと思いますが、増加したものとか意にそぐわないものを省いて有意差を出したのでしょうか?そういうのはだめじゃないかと(もしそうなら)。

ばらつきがあるけど差が見られるだろうと言うなら、Mさんのやり方がいいと思います。

結果に自身がなければ他の人にやってもらって再現性を見てもらうのも手です。

減少の度合いと増加の度合いはどんな感じですか?

(無題) 削除/引用
No.9104-2 - 2020/08/26 (水) 06:18:07 - M
自分だったら、他人からのクレームの心配より、まずは自分のデータに再現性がない事自体に不安に感じると思います。増加になった実験と、減少になった実験では、どのような違いがあるのかよく検討し、一定の方向の結果がコンスタントに得られるまで、実験系の改善を試みるべきように思いますが、どうでしょう?

今の状態で論文にせざるを得ない事情があるのであれば、平均値だけでなく、すべてのデータポイントを示す形で図にすると良いと思います。そうすれば、査読者も編集者も再現性に難がある実験結果である事を理解できます。その上で、p<0.05をもって良しとする判断が下されるのであれば、それはジャーナル側の判断ですから。読者としても、図を見て再現性に難がある事が最初から分かっていれば、再現実験して逆の結果になっても納得すると思います。再現性に難がある事を隠すような図にして投稿するのはやめた方が良いと思います。

不安定な結果がある実験のデータの再現性について 削除/引用
No.9104-1 - 2020/08/26 (水) 02:58:11 - メンタルmax
お世話になっております。初心者です。細胞株を用いたアッセイで、ある遺伝子を導入した群とコントロール群の2群間で比較しております。何度か試験した所、増加、減少、変化なしはありましたが減少するという結果でp<0.05となり、実験終了しました。恐らく何度か追試しても平均では減少という結果にはなると思います。最後の試験の結果がやや増加してしまい不安になっております。どこかで区切りをつけるべきとは思いますが、論文が世に出た後、他の研究者より逆の結果だとクレームがあったらどうしようなど不安に思っております。こういったご経験はありますでしょうか?中々、相談できる人がいないためご相談させて頂きました。よろしくお願いいたします。

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