BioTechnicalフォーラム [組織ホモジネートのタンパク質定量]

組織ホモジネートのタンパク質定量

No.9109-TOPIC - 2020/08/26 (水) 20:55:43 - ムーミン

いつもお世話になっております。
組織をThermoのT-PER bufferで溶解し10,000gで遠心、BCA法でタンパク質量を測定しています。
組織ホモジネートをT-PERで10倍、100倍としたところ、タンパク質量が1/10となりませんでした。（1/2くらいです)
いくつかのサンプルで試したところ、タンパク質量の傾向は希釈しても似たようになります。
スタンダードの検量線はきれいに引けるので手技的には問題ないかと思うのですが、この原因はどのようなことが考えられるでしょうか？
抽出したホモジネートのタンパク質量が多すぎる場合、このようなことが起こるのでしょうか？
　

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No.9109-11 - 2020/08/27 (木) 17:47:59 - ムーミン

ポン太さん

希釈にも同じバッファーを使用しております。

おおさん

詳細な解説ありがとうございます。
こちらの質問が分かり辛く申し訳ありません。
目的タンパク質のおおよその量は予備検討で分かっていましたが、サンプル自体の直線性を検討する必要があるのか？という質問でした。
こちらに関しては組織のタンパク質量をそろえて測定すれば解決する問題でした。

sxdcfvgyふさん

初めて腓腹筋のタンパク質を測定するので試しに希釈なし、10倍希釈、100倍希釈で測定しました。
希釈なしではレンジオーバーでしたので、10倍と100倍を比べ、直線性がないことに気づいたという経緯です。

みなさま

たくさんの回答ありがとうございました。
まず、遠心で組織を除去していたつもりでしたが、若干組織の残骸が残っており、3度遠心して完全に取り除きました。
同じプレートで倍々希釈をし、測定したところ、きれいな直線性がみられないのですが、希釈したサンプルを別のプレートで測定したところ、直線性がみられました。どういう理由でこのようになっているかもう少し確かめてみます。

(無題)

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No.9109-10 - 2020/08/27 (木) 11:04:25 - sxdcfvgyふ

希釈前の元サンプルの測定値も検量線の直線性のある範囲に収まっていますか?
もし1xサンプル（元のサンプル）の測定値がすでに検量線の直線性から外れてるか、あるいは外れかかっているならば（頭打ち状態）、その測定値自体があてにならないので、10倍希釈サンプルの測定値とそれを比較しても理論値どうりにはならないだろうと思いますし、その比較自体が科学的な意味をなさないと思います。

(無題)

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No.9109-9 - 2020/08/27 (木) 10:27:51 - おお

>[Re:6] ムーミンさんは書きました :
> おおさん
>
> 腓腹筋40mgくらいを400µlのBufferに溶解しました。
> メーカー推奨のプロトコルより大幅に濃いめです。
> 濃すぎが原因かもしれません。
> この後ELISAをする予定ですが、かなり濃くないと測れないようで、この場合、正確にでたタンパク質量の値で補正しても大丈夫でしょうか？
> ELISAでの希釈サンプルの直線性を検討する必要がありますか？
> ついでに教えていただけないでしょうか？

その方法があなたの対象の蛋白にとっていいかどうかわかりません。タンパク量が多すぎるとそれなりにELISAに干渉するものも多くなるでしょうがそれは計るもの使う抗体などにも依存するでしょうし、サンドイッチでなくてWellに吸着するタイプなら、その吸着のキャパを超えれば明らかにうまく計れません。

一般的な蛋白の解析にはその濃度では抽出が不十分になるような気がします。ただあなたの見るものがそれでも抽出されているというなら文句を言う筋合いもないわけで。

どれくらいの蛋白がその組織にあって、それをその容量で抽出したとすればどれくらいの濃度になるだろうと言うことは予測ができるだろうから、タンパク量を測るときどれくらい希釈すれば、測定可能な範囲内に入るか想像できるでしょうに。２０から４０倍希釈ぐらいはしないとだめじゃないかと思いますよ。自身で計算してみてください。

検量線希釈

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No.9109-8 - 2020/08/27 (木) 08:25:10 - ポン太

確認ですが、もちろん検量線作成の希釈はサンプルと同比率のT-PER使っていますよね？

(無題)

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No.9109-7 - 2020/08/26 (水) 22:55:19 - ムーミン

400マイクロリットルです。

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No.9109-6 - 2020/08/26 (水) 22:54:18 - ムーミン

おおさん

腓腹筋40mgくらいを400µlのBufferに溶解しました。
メーカー推奨のプロトコルより大幅に濃いめです。
濃すぎが原因かもしれません。
この後ELISAをする予定ですが、かなり濃くないと測れないようで、この場合、正確にでたタンパク質量の値で補正しても大丈夫でしょうか？
ELISAでの希釈サンプルの直線性を検討する必要がありますか？
ついでに教えていただけないでしょうか？

(無題)

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No.9109-5 - 2020/08/26 (水) 22:18:27 - おお

どれくらいの量（重量とか）の組織を、どれくらいのバッファーで溶かしてますか？きっとタンパク量がこすぎるのだと思います。

(無題)

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No.9109-4 - 2020/08/26 (水) 21:20:31 - ムーミン

sxdcfvgyふさん

G25さん

検量線がリニアの範囲内で測定できています。
確かにスタンダードの一番高い濃度付近のサンプルもありますが、10倍希釈のものが1/2の値で出るものでしょうか？

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No.9109-3 - 2020/08/26 (水) 21:14:40 - G25

サンプルの吸光度は、検量線がリニアである範囲に収まっていますか？
タンパク質が過剰だと吸光度は頭打ちになって比例関係じゃなくなりますけれど。