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(無題) 削除/引用 No.9118-6 - 2020/08/29 (土) 13:22:56 - kmkm たくさんのアドバイスありがとうございます！ これから、しっかり洗浄したいとおもいます。 ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.9118-5 - 2020/08/29 (土) 12:47:58 - asan 7エタでの洗いがあまいとそうなります。 複数回しっかり洗うようにすれば改善すると思います。 ま、吸光度でピークが出る程度のコンタミはぶっちゃけRTにはそこまで影響しないですけどね。

(無題) 削除/引用 No.9118-4 - 2020/08/29 (土) 11:34:17 - おお NEBのキットのTrouble Shootingでは https://www.neb.com/-/media/nebus/files/brochures/rna_tg.pdf?rev=c562c9893ccd4769ad08ef4a92577d4a Ensure wash steps are carried out prior to eluting sample. Use care to ensure the tip of the column does not contact the flow-through after the final wash. If unsure, please repeat centrifugation. When reusing collection tubes, blot rim of tube on a Kimwipe prior to reattachment to the column to remove any residual wash buffer. 手間がかけられるなら、一度エタ沈するとグアニジンはのぞけます。 こちらでは１００mMぐらいまでならさほど影響がないと書かれてますが、濃度まで見積もれますか？得られたRNAの濃度によっては希釈によって容認濃度が変わってくるでしょう。 In summary, we found that concentrations of guanidine thiocyanate of up to 100 mM in an RNA sample do not compromise the reliability of downstream applications." https://www.researchgate.net/post/How_can_I_improve_RNA_quality_with_low_260_230_ratio

(無題) 削除/引用 No.9118-3 - 2020/08/29 (土) 11:26:32 - くっぱ 抽出方法がわかりませんが、グアニジンはエタノールによく溶けますので、しっかりとエタノールを入れた後しっかりと転倒混和してください。

(無題) 削除/引用 No.9118-2 - 2020/08/29 (土) 11:10:04 - 太郎 グアニジンを用いるRNA抽出法であるならば、コンタミネーションが問題というよりも、精製過程でグアニジンがしっかり除けていないという問題なのではないでしょうか。 より精製度合いを上げるためにはウォッシュの改善を図ればよさそうな気がします。ウォッシュの回数を増やすとかの手段があろうかと思います。 qPCRに影響するかどうかは、グアニジン混入についてQiagen社が提供している情報を参照すれば宜しいかと思われます。あるいは、自分で意図的にグアニジンを混入させたcDNA溶液を作ってqPCRしたら分かるでしょう。

RNA抽出したサンプルにグアニジンが検出される 削除/引用 No.9118-1 - 2020/08/29 (土) 10:41:25 - kmkm 現在、研究室にて培養細胞やソーティングして回収した細胞をRNA抽出→c DNA合成→qPCRし、ある遺伝子のmRNAの発現レベルをみる実験を行っています。 RNA抽出する際に、コンタミしないように、マスク、手袋着用など徹底的な注意を払って実験を行なっているのですが、抽出後、濃度を測るとグアニジンが検出される時があります。 どうしてか分からず、未然に防ぐ方法などありましたら、教えていただきたいです。 また、グアニジンが混入してしまったサンプルは、qPCRの結果に影響を及ぼしてしまいますか？よろしくお願い申し上げます。

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