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(無題) 削除/引用 No.9143-36 - 2020/09/10 (木) 13:49:20 - AA 新品を使われているということですが、あんまりバック高いならキットがおかしい気もします。 開封して間もないのであればpromegaに伝えて交換してもらってはいかがでしょうか？ コントロール実験の結果とセルフの結果を伝えて、コントロールでもうまくいかないしセルフのバックグラウンドが高すぎる、ということであれば流石に対応してくれると思います。 あるいはTAに拘る必要がないなら普通の制限酵素を使ったクローニングやinfusionなどを使ったクローニングに変えるのが早道かもしれません

(無題) 削除/引用 No.9143-35 - 2020/09/10 (木) 11:57:30 - cal AA様 ご返信ありがとうございます。 ＞セルフのみでも200個生えるって結構多い印象ですが、 pGEM-Tのキットってそんなにバックグラウンド高かったですっけ？ ほとんど生えてこなかったような記憶がありますが・・・ ということでしたが、今回はそんなに多くのコロニーが生えてきました・・・セルフのみだとこんなに生えてこないと聞いていたので、私自身も非常に驚いています。

(無題) 削除/引用 No.9143-34 - 2020/09/10 (木) 11:53:03 - cal おお様 ご返信ありがとうございます。 ＞IntactのプラスミドをEcoRVとかSmaIできってそれにA付加していないPCRフラグメントをLigationするということです。 もちろん末端が突出している場合は酵素処理で平滑にしてからLigationできます。 ということでしたが、用いるプラスミドやリガーゼなどに指定はありますでしょうか。 突出末端に関しては、PCRの際にPrimeSTAR酵素を用いているので、平滑末端になっているので問題ないと思います。

(無題) 削除/引用 No.9143-33 - 2020/09/10 (木) 11:47:10 - AA セルフのみでも200個生えるって結構多い印象ですが、 pGEM-Tのキットってそんなにバックグラウンド高かったですっけ？ ほとんど生えてこなかったような記憶がありますが・・・

(無題) 削除/引用 No.9143-32 - 2020/09/10 (木) 11:40:31 - cal G25様 ご返信ありがとうございます。 ＞私が聞きたいのは実際に使用したligation産物中に含まれているベクター量あたりのcfu。青コロニーが出たというけれど、どれほどのベクター量で何個出たのか？ に関してです。質問の意味を汲み取れず、申し訳ありません。 青コロニーは約200個生えていました。また、Tベクターの量は50 ngでしたので、4×10^3 cfu/ugでした。 なお、青コロニーの数はインサートなしのセルフライゲーションのみの場合と比較してほぼ同等でした。なので、バックグラウンドだと考えています。 切出し精製に関しましてもアドバイスありがとうございます。 教授に相談したところ、同じようなことを言われました。しかし、溶液中のDNAも精製は知らなかったので、そちらに関しても相談してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.9143-31 - 2020/09/10 (木) 00:55:54 - おお >[Re:19] calさんは書きました : > プランBのようなものをもっておくべきなのですね。 > 知識不足で申し訳ないのですが、「ブラントでクローニングプラスミドに入れる」ということはどういうことなのでしょうか。ご教授頂ければ幸いです。 IntactのプラスミドをEcoRVとかSmaIできってそれにA付加していないPCRフラグメントをLigationするということです。 もちろん末端が突出している場合は酵素処理で平滑にしてからLigationできます。

(無題) 削除/引用 No.9143-30 - 2020/09/09 (水) 15:24:48 - G25 >切出し精製に関しましても、2回目の切出しをせずにエタ沈でピュアにしてからライゲーションに持ち込んでいきたいと思います。 まあ、今回の実験デザインではそれで構わないと思うんだけれど、 一応、目的と手段の整合性で言うなら、 そのステップはTaqポリメラーゼの除去または完全失活とdNTPの除去が主眼で、EtOH pptではどちらも十分に達成できない。ゲル精製システムはフラグメント精製（溶液状態のDNAの精製）もできるようになっているものなので、泳動を省いてフラグメント精製するのが簡単。じゃなきゃフェノール抽出。 もっとも、この場合、Taqがキャリーオーバーされていても影響ないので（ダウンストリームに基質となるDNAがないので悪さのしようもない）、精製せずに反応液を直接使ってもいいくらい。

(無題) 削除/引用 No.9143-29 - 2020/09/09 (水) 15:01:20 - G25 >大腸菌の形質転換効率としては、自作ではありますが、2×10^8 cfu/ug相当あります。 私が聞きたいのは実際に使用したligation産物中に含まれているベクター量あたりのcfu。青コロニーが出たというけれど、どれほどのベクター量で何個出たのか？ 例えばugあたり換算で10^4とかそれ以下なら、もとからあった固有のバックグラウンドで、90%以上青コロニーだったとしても当たり前だろうとか、 10^6くらいだったら、単なるバックグラウンドじゃなくて、なにかが起こっている、例えばちゃんとライゲーションは起こっていてインサートが入っていても青くなるケースを疑う、とかね。

(無題) 削除/引用 No.9143-28 - 2020/09/09 (水) 14:07:24 - cal がぁが様 ご返信ありがとうございます。 TOPO-TAクローニングキットのご提案ありがとうございます。教授にも相談してみようと思います。 様々なコツについてもアドバイス頂きありがとうございます。 (1)に関しましては、他の方々にもアドバイスを頂いてまして、がぁが様のご意見も取り入れて対策したいと思います。 (2)に関しまして、自作ではありますが、2×10^8 cfu/ug相当ありますので、問題はないと考えています。

(無題) 削除/引用 No.9143-27 - 2020/09/09 (水) 14:00:38 - cal wwn様 ご返信ありがとうございます。 プランBのご提案ありがとうございます。 in fusionに関しては、数年前に当研究室で行ったものの上手くできなかったという過去を聞いたことがあります。 iVEC3に関しては非常に面白そうだなと思いました。教授に掛け合ってみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.9143-26 - 2020/09/09 (水) 13:54:38 - cal G25様 ご返信ありがとうございます。 大腸菌の形質転換効率としては、自作ではありますが、2×10^8 cfu/ug相当あります。 また、Tベクターと目的の遺伝子をライゲーション、キットに付属しているcontrol insert DNAをライゲーション(ポジコン)、insertなしでセルフライゲーションのみ(ネガコン)の3パターンを行い、大腸菌に導入してブルーホワイトセレクションを行いました。 その結果、ポジコンでは60%以上の白コロニーが確認できました。 一方、ネガコンではセルフライゲーションの青コロニーが確認できたと同時に、目的遺伝子をライゲーションした際とコロニー数がほぼ同等でした。もちろん、青コロニーです。 つまり、目的遺伝子を行った際はバックグラウンドと同じことが分かりました。 確かに決めつけは良くないですが、UV照射に関しましては、他の方からもご意見を頂いているので、早急に対策を講じたいと思います。 切出し精製に関しましても、2回目の切出しをせずにエタ沈でピュアにしてからライゲーションに持ち込んでいきたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.9143-25 - 2020/09/09 (水) 13:42:35 - cal ポン太様 ご返信ありがとうございます。 確かに、UV照射には十分に対策を練ってはいませんでいた。 他の掲示板でも同じような方がいて、その掲示板では、UV照射における様々な対策が書かれていました。なので、そちらを参考にして今後は対策していこうと思います。 ライゲーション時の量比に対するアドバイスを様々頂きありがとうございます。 Tベクターの量をいじることで実質的にインサート量をあげることができるのは盲点でした。 コンピテントセルは自作ではありますが、2×10^8 cfu/ug相当ありますので、Tベクターの量を減らしても問題はなさそうですね。 ポン太様の意見を参考に検討をしてみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.9143-24 - 2020/09/09 (水) 11:46:02 - がぁが cal様 TOPO-TAクローニングキットを使ってはどうですか？ と提案しようとしましたが、このキットはTOPOよりも長鎖DNAのクローニングにおいて優れている、という触れ込みなのですね。 TOPO-TAクローニングキットの使用では、4kbp位のサイズでは楽勝で、14.5kbpのPCR産物もクローニングできた経験があります。 コツは、 (1)ゲル切り出し時にUVをあてない（2レーンに分けてエチブロを含まないゲル、ランニングバッファーで泳動し、泳動後、ゲルを分割して一方のレーンだけ染めてUV照射してバンドの位置に印を付け、UV照射を止めてから、もう一方のゲルを隣に持ってきて、該当するところを切り出す等） (2)形質転換効率の高いコンピテントセルを使う（自作ケミカルコンピテントセルでしたが） でした。 wwnさんがおっしゃるように、in fusionやiVEC3も良さそうですね。長いプライマーが必要なので、その点がどうかですが、iVEC3ならライゲーション反応が菌体内で起こるので、菌株を維持していれば、ライゲーションキットはずっと買う必要がありませんね。

(無題) 削除/引用 No.9143-23 - 2020/09/09 (水) 09:58:33 - wwn TAクローニングしなくって久しいです。 ブラントエンド用のZeroBluntなどのキットも使わなくなりました。 PCRで増やす前提ならin fusionやiVEC3などをもっぱら使用しています。 TAクローニングの解決にはなりませんが、プランB案としていかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.9143-22 - 2020/09/08 (火) 18:23:13 - G25 青コロニーは普通に空でしたか。 ではその生えてきたコロニーは、調整されたベクター固有のバックグラウンドのレベル（インサートなしのライゲーションやライゲーションなしでも生えてくるバックグラウンド）を超えるものではないということでしょうか。形質転換効率として　cfu/ugベクターの値を出してくれると話が早いんですが、どうも文脈からは、バックグラウンドとは差別化できるレベルの多数のコロニーが生えたように思い込んでしまったので。 問題なくルーチンで動いているときはいいですが、ハマったときには、基本に戻ってステップごとにコントロールをとってトラブルシュートしたほうがいいです。 ライゲーションなし群、インサートなしライゲーション群とか。 UVの当て過ぎですべてのインサートDNAにピリミジンダイマーが入って、それが入ったプラスミドが選択的に不活性化されている、というシナリオはありえますが、決めつけないでいきましょう。 ゲル切り出し精製でできることは、PCRの副産物（非特異的産物）を除去することと、プライマー、プライマーダイマー、酵素や基質の除去です。 副産物の精製意外はゲル切り出し以外でもできるので、手順の中に一回副産物を除くゲル切り出しをしたら、あとは別の方法を使ったほうが楽だし無用のトラブルを避けられる。

(無題) 削除/引用 No.9143-21 - 2020/09/08 (火) 18:04:21 - ポン太 ＞今回の場合「T-vectorとのligationに有効な末端を持ち、かつUVによるダメ＞ージを受けていないinsert」の実濃度の低下ということを考える必要がある＞かもしれません。 ＞ということでしたが、全insertの量を増やすことができれば実濃度の低下を＞抑えることができるという理解でよろしいでしょうか。 結論から言えばYESです。 しかし、個人的には、UV照射に十分に対策を取っていないとご自身が感じていたのであれば、そこが原因のように思いますので、対策を取ってやり直すことを前提にした方が良いように思います。したがって、下記の話は、現在お持ちのフラグメントで対応するならばという条件付き（ある意味闇実験のようなものですね）でお聞きください。 Vector:Insert=1:3とのこと。 3 kbはかなり長いですので、ただでさえ「楽にcloningする」には、もっとinsert比が高い方が良いですね（1:10ぐらいでも良いと思います）。実務的には、insert濃度が薄くても、Vectorは減らすことでvector:insert比をいじることはできます。 例えば T-vector 0.25 uL: Insert 3.75 uL であれば、1:15となりますね。 T-vector 0.1 uL:Insert 3.9 であれば1:40ぐらいでしょうか。 特に今回はT-vectorは市販のものですので、competent cellが「良いもの」を使っていれば、例えvectorを0.1減らしても「利用可能なinsert」があれば十分いけるはずです。裏を返せば、T-vectorも自作にしており、UVのダメージについてvector側も考慮しなくては行けないような場合は、ちょっと無理でしょうね。 また、必ずT-vector 0.25 uL: ddH2O 3.75 uLのようなvector量ごとのコントロールはおいて、コロニーの数に差が出るかも重要な判断材料としてください。 例） T-vector 1 uL　insertなし 50 T-vector 1 uL　insertあり 50 T-vector 0.1 uL　insertなし 5 T-vector 3.9 uL　insertあり 10 のようにinsert有無でのコロニー数の比率に差が出てくるととある程度期待はできます。 播種する量も必ず、ふってくださいね。

(無題) 削除/引用 No.9143-20 - 2020/09/08 (火) 15:18:47 - cal ぽん太様 ご意見を頂きましてありがとうございます。 最後のligation時のinsertの濃度は約40 ngであったと考えています。アガロース電気泳動後のマーカーとの比較から判断をしました。 キットのTベクター50 ng/ulであると記載がありました。また、insertは約3500 bp, Tベクターは約3000 bpです。なので、vector:insert=1:3の割合でligationを行いました。 やはり、DNAへのUV照射は影響は大きいのですね。今後はおおさんからもご指摘あったように参考にさせて頂きます。 ＞今回の場合「T-vectorとのligationに有効な末端を持ち、かつUVによるダメージを受けていないinsert」の実濃度の低下ということを考える必要があるかもしれません。 ということでしたが、全insertの量を増やすことができれば実濃度の低下を抑えることができるという理解でよろしいでしょうか。 ご教授いただければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.9143-19 - 2020/09/08 (火) 15:04:38 - cal おお様 大変丁寧にアドバイスを頂き、ありがとうございます。 A付加後のゲル精製は省いていいのですか。個人的にA付加後にエタ沈を行った方が良いのかなと思います。 A付加後のゲル精製は省いていい理由としましては、DNAに無駄なダメージを与えないためという理解でよろしいでしょうか。 ＞�FPCR産物3ulとpGEM®-T Easy Vectorキット(プロメガ)に付属している この直前にDNA量を見積もってますか？ に関してですが、ライゲーション前のアガロース電気泳動でおおよそのDNA量を確認し、ある程度の見積もりはしています。 >�Gライゲーション後にエタノール沈殿を行いました。 これ、必要何でしょうか？ に関してですが、エレクトロポレーションによって大腸菌に導入する際に、DNAができるだけピュアな状態の方が良いということを聞いています。なので行っています。 今までラボのプロトコル通りにやれば大丈夫と盲目的に実験を行っていました。なので、昨日に初めてプロメガ様のプロトコルを確認しました。自分で確認することも大切なのだと痛感いたしました。 確かにプロトコルには青コロニーになる可能性についても言及されていました。 別の方からもご指摘があったので、本日に青コロニーを拾ってプラスミド抽出、制限酵素消化、アガロース電気泳動を行いました。 しかしながら、全てTベクターのスーパーコイルだと思われるバンドが確認できました・・・ ですので、おお様のアドバイスを参考にさせて頂きたいと考えております。 プランBのようなものをもっておくべきなのですね。 知識不足で申し訳ないのですが、「ブラントでクローニングプラスミドに入れる」ということはどういうことなのでしょうか。ご教授頂ければ幸いです。 TベクターのキットにInsertのポジコンがついていることも昨日に気づきました。なので、昨日にライゲーションをして今日に大腸菌に導入、プレートに植菌しようと思っています。結果が出ましたら、改めてご報告させて頂きます。 ATPに関しましては、新品のキットを開けてから数回しか凍結融解をしていないので、問題ないと思います。 長文失礼いたしました。

(無題) 削除/引用 No.9143-18 - 2020/09/08 (火) 14:46:53 - ポン太 最後のligation時のインサートの濃度はどのくらいですか？ インサートの量は、ある程度短い場合はどうにでもなるケースが多いですが、長くなってきますとvector:insertのモル比は重要なファクターになってきます。 特に、ハンドリングするDNA長が長ければ長いほどおおさんがご指摘されているUVの影響は大きく出ます（UV損傷の確率論）。 今回の場合「T-vectorとのligationに有効な末端を持ち、かつUVによるダメージを受けていないinsert」の実濃度の低下ということを考える必要があるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.9143-17 - 2020/09/08 (火) 14:29:03 - cal G25様 お時間を割いて頂いてアドバイスをもらっているにもかかわらず、返信が遅れてしまい申し訳ありません。 様々なご意見ありがとうございます。A付加に関する質問に対してもお答えいただきありがとうございます。 非常に勉強になります。 本日、昨日にご指摘いただいたように、青コロニーを拾ってプラスミド抽出、制限酵素消化、アガロース電気泳動を行いました。 しかしながら、全てTベクターのスーパーコイルだと思われるバンドが確認できました・・・ G25様から考えて、他の要因は考えられますでしょうか。ご返信いただければ幸いです。

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