Bio Technical フォーラム

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RT-PCRの内在性コントロール トピック削除
No.9149-TOPIC - 2020/09/09 (水) 14:21:28 - ぱん
細胞株に複数の薬剤を投与し、RT-PCRで遺伝子の変化を確認しています。
RNA量を揃えて逆転写しているのですが、RT-PCRでGAPDHが減少してしまうサンプルがあります。GAPDHが内在性コントロールとしてふさわしくないのではと考え、18S rRNAを内在性コントロールにして再実験しましたが同様の結果になりました。RNA量を揃えているのに内在性コントロールが減少してしまう場合は、どのようなことが考えられるでしょうか。この結果によって得られた結果は妥当といえるでしょうか。ご意見頂けますと幸いです。
 
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(無題) 削除/引用
No.9149-5 - 2020/09/10 (木) 00:50:11 - おお
細胞がかなり調子悪くなっているとかないですか?
Spikeを入れると納得がいくかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.9149-4 - 2020/09/09 (水) 21:30:21 - M
薬剤投与を何回か繰り返し、同一の薬剤組み合わせ投与の場合に限り、再現性を持ってGAPDHと18Sが低下するなら、その組み合わせの薬剤投与によりGAPDHと18Sの発現が低下する可能性を念頭に、他の内在性マーカーをテストすると良いのではないでしょうか。再現性は何回(薬剤投与の実験を何回)確認されましたか?

結果の解釈については、GAPDHと18Sが下がる薬剤処理で、目的の遺伝子の発現が上がるのであれば、正確性は欠きますが、一定の傾向については結論できるのではないでしょうか? マーカーと同じ方向に動いたり、目的遺伝子の発現に変化がない場合は、解釈不能だと思います。

(無題) 削除/引用
No.9149-3 - 2020/09/09 (水) 19:22:38 - 18
リボゾームに大きな変化が起きたり、タンパク質合成系で何か起きていれば、あるいはそういうこともありうるだろうと思います。大事なことは、自分の目と頭を、ーーーのはず、とか、ーーーねばならない、とかの束縛から解放することです。GAPDH発現が変化するのは割とよく遭遇すると聞きます。

(無題) 削除/引用
No.9149-2 - 2020/09/09 (水) 14:50:40 - G25
GAPDHもrRNAもインスリシグナル系によって転写量が支配される典型

RT-PCRの内在性コントロール 削除/引用
No.9149-1 - 2020/09/09 (水) 14:21:28 - ぱん
細胞株に複数の薬剤を投与し、RT-PCRで遺伝子の変化を確認しています。
RNA量を揃えて逆転写しているのですが、RT-PCRでGAPDHが減少してしまうサンプルがあります。GAPDHが内在性コントロールとしてふさわしくないのではと考え、18S rRNAを内在性コントロールにして再実験しましたが同様の結果になりました。RNA量を揃えているのに内在性コントロールが減少してしまう場合は、どのようなことが考えられるでしょうか。この結果によって得られた結果は妥当といえるでしょうか。ご意見頂けますと幸いです。

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