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ファーウェスタンブロッティング法のプロトコルに関して トピック削除
No.9183-TOPIC - 2020/09/28 (月) 15:17:38 - 生化学未熟者
初めて質問させて頂きます。ご教授してくだされば幸いです。

私は現在、未知の膜タンパク質の受容体の探索及び同定のため、受容体と結合する大腸菌発現系のHisタグ精製タンパク質を用いて、Pull-down及びFar-westernを行っています。

Pull-downにおいて受容体だと思われるタンパク質があることを確認しました。
このPull-downのゲルを転写し、メンブレン上のタンパク質を塩酸グアニジンで再生・変性後、精製タンパク質を加えてインキュベートし、精製タンパク質に対する抗体で、Pull-downで確認された受容体のバンドと同じ分子量にバンドが見えるよう試みています。
(Pulldownのサンプルに関してですが、細胞のライセート,Hisタグ精製タンパク質,Ni-magneticビーズをエッペンで混和し、磁石でNiビーズを引き寄せ上清除去後,Sample buffer solutionを加え95℃, 5min ヒートブロック後に磁石で上清を回収したサンプルです。)

しかし、Pulldownで確認した受容体であろうバンドを全く確認することができませんでした。
その原因として、@washの際にTween-TBSを用いているため、メンブレン上の受容体と結合した精製タンパク質がwashの際に剥がれてしまった、あるいはAタンパク質の変性・再生のステップが上手くできていないことだと考えています。

論文のプロトコルを参考に自分でプロトコルを作製したのですが、私が作製したプロトコルに自信がなく、
もしもFar-western を行ったことがある方がいらっしゃいましたらアドバイスや改善点をご教授してくだされば幸いです。

【方法(メンブレンに転写後から)】
@ 6M guanidine-HCl 変性バッファー(8Mguanidine-HCl 9.375mL, 1M tris-HCl(pH7.5) 0.25mL, 10% Tween 20, 62.5µL, 1M DTT 12.5µL, DDWを加えて12.5mLにメスアップ)及び、0M guanidine-HCl 再生バッファー(1M Tris-HCl(pH7.5) 1mL, 10% Tween-20 250µL, 1M DTT 50µL, DDWを加えて50mLにメスアップ)を作製し、6M,3M,1.5M,0.75M,0.38M,0M(各6.25 mL)まで段階希釈した溶液を作製して4℃に保存
A プラスチック箱に6M guanidine-HCl(6.25mL)を加えメンブレンを浸し 4℃,10min,シェイカーで震盪
BAを新しいプラ箱に3M溶液を加えメンブレンを移して同条件で震盪し、これを0Mまで繰り返す。
C新しいプラ箱にOdyssey(ブロッキングバッファー)を5mL加え、メンブレンを加えて 4℃, 30min, シェイカーで震盪
Dこのプラ箱の溶液に精製タンパク質を5µg加え4℃, オーバーナイト, シェイカーで震盪
E翌朝,Tween-TBS(TBST)でwash 4℃, 10min, シェイカーで震盪。これを3回繰り返す。
F溶液除去後、5mLのブロッキングバッファーに1次抗体を入れた溶液を箱に入れ室温, 2hr, シェイカーで震盪
G溶液除去後、TBST 5mL で軽く2回洗浄後, ブロッキングバッファーに2次抗体を入れた溶液を箱に入れ室温, 1hr, シェイカーで震盪
HTBST 5mL で2回wash後、TBST 5mL でwash 室温, 1hr, シャイカーで震盪
ITBSTで2回wash後,蛍光を検出
 
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(無題) 削除/引用
No.9183-5 - 2020/09/29 (火) 19:16:35 - zxcvf
Pull-downで受容体だと思われるタンパク質を確認した、というところが意味がよくわからないので具体的に受容体を含むであろうそのサンプルはどういったもので、何をどのようにして確認(確認ということなので、すでに何かそうなることが予想できることがあったということでいいですか)したのか詳細をお願いします。

(無題) 削除/引用
No.9183-4 - 2020/09/29 (火) 18:41:17 - qq
プルダウンされたタンパクを同定するほうが早いかもしれない。
ファーウェスタンできるのであれば強いサポートになるとは思うが、できなかったとしても結合しないことにはならないと思うよ。
プルダウンで変性たんぱく質に結合するタンパクが引っかかってくることは多いので、注意深さも必要でしょう。
プルダウンのことろで、可能な範囲でノンスぺでないことを確認する必要はあるね。

(無題) 削除/引用
No.9183-3 - 2020/09/29 (火) 05:46:55 - おお
>Pull-downにおいて受容体だと思われるタンパク質があることを確認しました。

どのようにして?

ファーウェスタンは膜でのRenaturationのプロセスが検証できないので、系がワークするように理論的なアプローチを取るのが難しいです。蛋白によってはRenaturationが非常に難しいものもあるでしょう。ターゲットの量もかなり影響があるでしょう。過去にそのインターラクションを検出されていないのであれば、暗い部屋であるかないかわからないものを手探りで探している状態とも言えるのであまり深入りしないほうがいいと思いますが。

違う方法論も考えながらいくらかやるとすると、

Renatureのステップをはぶく。Renatureをせずとも本来の構造を取り戻す蛋白もあるようです。guanidineしょりでおそらくいくらか蛋白は膜から遊離してくるだろうと思えますから量を考えても有利です。

guanidineの代わりにUreaを試す。Ureaは徐々に希釈するより急激に除くほうがいいのでUrea処理後いきなりTBSTなどにBuffer Changeするといいでしょう。

Interactionが弱いならHisタグ精製タンパクを結合させて、洗ってからグルタルアルデヒドなどで膜に結合している蛋白にクロスリンクさせてしまう。

Native gelで電気泳動する。効率はともかく(特にPVDFなら)アルコール抜きTG BufferでもTransferはできるし、なるべく変性しないようにTransferする。

Niカラムを使うとかなりたくさんのノンスペが共存していると思いますが、一層のことそのHisタグ精製タンパクをAffi-Gelなどのレジン(各社この手のゲルは出していると思う)にこばれんとに結合してアフィニティーカラムをつくり、乗せるタンパク量を多くするか、繰り返し精製するか、スケールを大きくしてなるべくスペシフィックなものを濃縮すると、その後ファーウエスタンにしろそうでないにしろいろいろやりやすいのではないかと思います。

µL,について 削除/引用
No.9183-2 - 2020/09/28 (月) 15:21:01 - 生化学未熟者
『µL,』について文字化けしているのですが、正しくはマイクロリットルです。よろしくお願いいたします。

ファーウェスタンブロッティング法のプロトコルに関して 削除/引用
No.9183-1 - 2020/09/28 (月) 15:17:38 - 生化学未熟者
初めて質問させて頂きます。ご教授してくだされば幸いです。

私は現在、未知の膜タンパク質の受容体の探索及び同定のため、受容体と結合する大腸菌発現系のHisタグ精製タンパク質を用いて、Pull-down及びFar-westernを行っています。

Pull-downにおいて受容体だと思われるタンパク質があることを確認しました。
このPull-downのゲルを転写し、メンブレン上のタンパク質を塩酸グアニジンで再生・変性後、精製タンパク質を加えてインキュベートし、精製タンパク質に対する抗体で、Pull-downで確認された受容体のバンドと同じ分子量にバンドが見えるよう試みています。
(Pulldownのサンプルに関してですが、細胞のライセート,Hisタグ精製タンパク質,Ni-magneticビーズをエッペンで混和し、磁石でNiビーズを引き寄せ上清除去後,Sample buffer solutionを加え95℃, 5min ヒートブロック後に磁石で上清を回収したサンプルです。)

しかし、Pulldownで確認した受容体であろうバンドを全く確認することができませんでした。
その原因として、@washの際にTween-TBSを用いているため、メンブレン上の受容体と結合した精製タンパク質がwashの際に剥がれてしまった、あるいはAタンパク質の変性・再生のステップが上手くできていないことだと考えています。

論文のプロトコルを参考に自分でプロトコルを作製したのですが、私が作製したプロトコルに自信がなく、
もしもFar-western を行ったことがある方がいらっしゃいましたらアドバイスや改善点をご教授してくだされば幸いです。

【方法(メンブレンに転写後から)】
@ 6M guanidine-HCl 変性バッファー(8Mguanidine-HCl 9.375mL, 1M tris-HCl(pH7.5) 0.25mL, 10% Tween 20, 62.5µL, 1M DTT 12.5µL, DDWを加えて12.5mLにメスアップ)及び、0M guanidine-HCl 再生バッファー(1M Tris-HCl(pH7.5) 1mL, 10% Tween-20 250µL, 1M DTT 50µL, DDWを加えて50mLにメスアップ)を作製し、6M,3M,1.5M,0.75M,0.38M,0M(各6.25 mL)まで段階希釈した溶液を作製して4℃に保存
A プラスチック箱に6M guanidine-HCl(6.25mL)を加えメンブレンを浸し 4℃,10min,シェイカーで震盪
BAを新しいプラ箱に3M溶液を加えメンブレンを移して同条件で震盪し、これを0Mまで繰り返す。
C新しいプラ箱にOdyssey(ブロッキングバッファー)を5mL加え、メンブレンを加えて 4℃, 30min, シェイカーで震盪
Dこのプラ箱の溶液に精製タンパク質を5µg加え4℃, オーバーナイト, シェイカーで震盪
E翌朝,Tween-TBS(TBST)でwash 4℃, 10min, シェイカーで震盪。これを3回繰り返す。
F溶液除去後、5mLのブロッキングバッファーに1次抗体を入れた溶液を箱に入れ室温, 2hr, シェイカーで震盪
G溶液除去後、TBST 5mL で軽く2回洗浄後, ブロッキングバッファーに2次抗体を入れた溶液を箱に入れ室温, 1hr, シェイカーで震盪
HTBST 5mL で2回wash後、TBST 5mL でwash 室温, 1hr, シャイカーで震盪
ITBSTで2回wash後,蛍光を検出

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