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(無題) 削除/引用 No.9191-10 - 2020/10/05 (月) 17:52:57 - Kote2 >[Re:9] おおさんは書きました : > >バッファー交換等していないので、確かにパパインが入っていると思います。 > >パパインがあると、濃度やSDSに影響するのでしょうか。 > > パパインが入っているなら測定したタンパク量にパパインの量が加算されていませんかという質問ですが、私はよくわからないですが無視できるほどの量なんでしょうか？ そんなに入っていないです。 とりあえず、BCA法にて測定してみたいと思います。 ありがとうございました。 >[Re:8] よっしーさんは書きました : > ポリクロでしたか． > fさんのおっしゃる通り検量線か，BCA法，Bradford法，Lowry法などですかね． ありがとうございます。ご指摘いただいたことを確認しながらBCA法にて測定してみます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9191-9 - 2020/10/03 (土) 02:47:20 - おお >バッファー交換等していないので、確かにパパインが入っていると思います。 >パパインがあると、濃度やSDSに影響するのでしょうか。 パパインが入っているなら測定したタンパク量にパパインの量が加算されていませんかという質問ですが、私はよくわからないですが無視できるほどの量なんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9191-8 - 2020/10/02 (金) 09:25:45 - よっしー ポリクロでしたか． fさんのおっしゃる通り検量線か，BCA法，Bradford法，Lowry法などですかね．

(無題) 削除/引用 No.9191-7 - 2020/10/02 (金) 09:22:04 - よっしー データーベースにある配列を使って全長とFabとのモル吸光係数などを計算してみてはどうですか？きっと想像と全然違う結果になると思います． あと，Fabは１つの抗体から2分子できますよね．そのあたりもお忘れなく．

(無題) 削除/引用 No.9191-6 - 2020/10/02 (金) 08:41:26 - Kote2 >[Re:4] おおさんは書きました : > ＞吸光係数はIgGと同じ1.4なのでしょうか。 > 単位がわからないので答えようがないですが、、、数字的には重量ベースのように思えます。それならばペプチドのトリプトファン、フェニルアラニンとチロシンの数で決まりますので、ほぼ均一に散らばっているとしたならば係数は似たようなものでしょう。ただしペプチドは固有の配列を持っているわけですから固有のトリプトファン、フェニルアラニンとチロシンの数を持っています。Webを検索すれば配列をもとに係数を計算してくれるSiteを見つけることができると思います。 > > Mole数ベースだと短いペプチドのほうが分子内のトリプトファン、フェニルアラニンとチロシンの数が減るわけだから、それにおおじて係数は小さくなります。 > > まずはそのへんを考察してください。と言いたいところだが、ProteinA精製のフロースルーはパパインが含まれていますよね。それともPapain Agaroseみたいなの使ってるのかしら。 > ありがとうございます。 キットにあるProteinAレジンを使用しました。 バッファー交換等していないので、確かにパパインが入っていると思います。 パパインがあると、濃度やSDSに影響するのでしょうか。 還元してSDSをしても同じ状況になりますでしょうか。 >[Re:3] qqさんは書きました : > 抗体はポリクロでしょうか？ > ポリクロのFabはいっそうブロードになるんじゃないかな？ ありがとうございます。 パパイン消化が初めてで、まさにポリクロです。 ポリクロだとブロードになるのでしょうか？ >[Re:2] fさんは書きました : > パパインも含む。 > SDS-PAGE & CBB > BSA (or IgG)検量線などでの定量が妥当。 ありがとうございます。 検討してみます。 パパイン消化が初めてでお恥ずかしいのですが、 パパインがあるとSDSに影響があるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.9191-4 - 2020/10/01 (木) 23:44:39 - おお ＞吸光係数はIgGと同じ1.4なのでしょうか。 単位がわからないので答えようがないですが、、、数字的には重量ベースのように思えます。それならばペプチドのトリプトファン、フェニルアラニンとチロシンの数で決まりますので、ほぼ均一に散らばっているとしたならば係数は似たようなものでしょう。ただしペプチドは固有の配列を持っているわけですから固有のトリプトファン、フェニルアラニンとチロシンの数を持っています。Webを検索すれば配列をもとに係数を計算してくれるSiteを見つけることができると思います。 Mole数ベースだと短いペプチドのほうが分子内のトリプトファン、フェニルアラニンとチロシンの数が減るわけだから、それにおおじて係数は小さくなります。 まずはそのへんを考察してください。と言いたいところだが、ProteinA精製のフロースルーはパパインが含まれていますよね。それともPapain Agaroseみたいなの使ってるのかしら。

(無題) 削除/引用 No.9191-3 - 2020/10/01 (木) 21:24:32 - qq 抗体はポリクロでしょうか？ ポリクロのFabはいっそうブロードになるんじゃないかな？

(無題) 削除/引用 No.9191-2 - 2020/10/01 (木) 19:25:11 - f パパインも含む。 SDS-PAGE & CBB > BSA (or IgG)検量線などでの定量が妥当。

Fabの濃度 削除/引用 No.9191-1 - 2020/10/01 (木) 18:12:28 - Kote2 IgGをパパイン消化してFabを作製しました。 ProteinA精製のフロースルーを用いてFC領域を除去しました。 形が変わっても、280nmにて吸光を測定すると、 吸光係数はIgGと同じ1.4なのでしょうか。 同様の方法で非還元にてSDSを実施したところ、 バンドが薄くしか見えず、濃度計算がおかしいのかと思っております。

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