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qRT-PCRの同一サンプルでの誤差 トピック削除
No.9198-TOPIC - 2020/10/05 (月) 16:49:17 - flower
お世話になっております。
qRT-PCRを最近やり始めたのですが、同一のテンプレートを使用しているのにも関わらず、発現量が倍近くずれて計算されてしまい、困っています。

使用機器はStepOnePlus (Thermo)
使用試薬はTHUNDERBIRD SYBR qPCR mix (東洋紡)
PCRチューブ含め、試薬以外はすべて純正品を使用しています。
また、テンプレートcDNAはReverTra Ace(東洋紡)を使用しています。
研究室内の他の人も同じ試薬を使用していますが、特に問題なく実験できているようです。

プライマーはオリジナルで設計し、ΔCt値がすべて同じになるかどうかを確かめるためにcDNA濃度を振って試したのですが、あまりにばらつきが大きいためそもそも同じテンプレートで同じように増えるのかを確かめようとしたら、同じテンプレートでもばらついてしまい、こちらで質問するに至りました。

使用している機器・試薬はROX補正付きのもので、少なくとも見た目にはピペッティングミスによる液量差は見られません。
また使用しているピペットマンは、年度初めに自分でRO水を測り取り質量を測ることで、目的量がきちんととれていることを確認しています(もちろん目安程度にしかならないとは思いますが)。
メルトカーブを確認する限り、プライマーダイマーは生じていません。またテンプレートなしのコントロールでの増幅は見られませんでした。
ピペットマンは他の実験でも使用していますが、チップ・滅菌水はPCR専用のものを用意して使うようにしています。

原因としてどのようなことが考えられるでしょうか?
また、自分の手腕のミスであるとすれば、他にどのような点に気を付ければよいでしょうか?

どうぞよろしくお願いいたします。
 
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(無題) 削除/引用
No.9198-18 - 2020/10/17 (土) 16:12:53 - ん
No.9198-4 現在は、cDNAとプライマー以外の溶液を混合して分注するようにしています
No.9198-15 確かにプラトーに達した際の蛍光強度が異なっています!

確認ですが,cDNA以外の全ての試薬をミックスして分注し,最後にcDNAを加えて反応してもぶれますか?

(無題) 削除/引用
No.9198-17 - 2020/10/17 (土) 07:18:43 - まっくろん
 私もおおさんと同感です。「機器に問題がない」という確証があってこそ、時間や試薬などのコストをかけて手技の原因を探すことが意味を持つと思います。

(無題) 削除/引用
No.9198-16 - 2020/10/17 (土) 01:27:56 - おお
>[Re:13] 愚地独歩さんは書きました :
> プラトーに達した時の蛍光強度はウェル間で揃っていますでしょうか?
> これが揃っていないときにCtを閾値法で定めると、誤差がかなり大きくなります。
> この場合second derivative maximum法などを使うと改善します。

そういう対処法もあるのですね。でもすべてミックスしたPCR反応溶液を複数のチューブに分注してもそういうことが起こるということがちょっと解せない。

どうもマシーンの方を疑いたくなる。皆さんはどう思っていらっしゃるのだろうか。。。

(無題) 削除/引用
No.9198-15 - 2020/10/15 (木) 09:14:27 - flower
すみません、誤って昨日投稿したメッセージを削除してしまいました。。。

皆さま、たくさんのコメントをいただき本当にありがとうございます。
また返信が遅くなり申し訳ありません。

>G25様
おっしゃる通り、一般的なレプリケートの方法で作成したもので、一回の測定時にテクニカルレプリケート間で最大2倍ほどの発現量の差が検出されてしまいます。電動ピペットを使用しても改善されませんでした。

>D様
RNA抽出時の問題がここに出てきている可能性もあるのですね。
一応、100ng/ul以上、OD260/230, OD260/280共に1.8以上で抽出できたRNAだけcDNA合成に用いるようにはしているのですが、バイオアナライザー等での確認も加えた方がよいのでしょうか…?
また、どういった点を見ればRNA抽出時の問題かどうか、またどの点に今後気を付けるべきかなどもご教示いただければ幸いです。

ウェル間での傾向は特には見られませんでした。

>BlueComma様
PCRプレートのどの程度の汚れがどの程度測定に影響するのか、確かに気になります。
私も操作時は手袋を着用した上で(コンタミを防ぐ目的もありますが)プレートはきれいなアルミホイルを敷いてその上にのみ置くようにしています。そのようなラックもあるのですね!

>愚痴独歩様
確かにプラトーに達した際の蛍光強度が異なっています!教えていただいた計算方で再度計算してみます、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.9198-14 - 2020/10/15 (木) 08:38:31 - TS
横からですみません。

>多分実施されていると思いますが、ミキシングはいかがでしょうか。

定量PCRでミキシング(反応液ですよね)ってどのくらい重要なんでしょうか。
わたしはタッピングとスピンダウンで数回って感じですけど、
同僚はどうせPCR反応の過熱で対流が起きて混ざるから必要ないよと言っていてました。
色々聞くと確かに「混ぜない派」がそれなりにいるように感じています。
ずっともやもやしてたことなので皆さんのご意見とご経験をいただけると幸甚です。

(無題) 削除/引用
No.9198-13 - 2020/10/15 (木) 05:45:19 - 愚地独歩
プラトーに達した時の蛍光強度はウェル間で揃っていますでしょうか?
これが揃っていないときにCtを閾値法で定めると、誤差がかなり大きくなります。
この場合second derivative maximum法などを使うと改善します。

(無題) 削除/引用
No.9198-12 - 2020/10/14 (水) 21:04:34 - BlueComma
コメントと言うか横からの質問なのですが、トピック主の問題に対するヒントがあればと思い投稿します。

PCRプレートの汚れで計測値はどれほど変動するものなのでしょうか?
ネット上の情報には「プレートにマジックで直接書き込むな」「プレートの底が実験台に接地しないように」と書いてありますが、皆さまどれほど注意されているのか気になっています。

私自身は以下の2点に気をつけています。

1. 手袋着用(指紋が付着するとシグナルが乱れそう)

2. PCRプレートは常にラック(下記の商品)に入れて操作
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4379590#/4379590

特に2について、マスターミックス分注時にもラックに入れて行っています。アイスブロックを使うと結露した水滴でプレートが汚れそうな気がしています。温度上昇を防ぐために、深めの容器に氷を敷き詰めてその上で空冷しながら作業しています。皆さまはどのような点に注意して作業をされていますか?

(無題) 削除/引用
No.9198-11 - 2020/10/14 (水) 20:53:10 - MJ
多分実施されていると思いますが、ミキシングはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.9198-9 - 2020/10/08 (木) 11:08:26 - D
RNA抽出が下手なんじゃないのかな?

(無題) 削除/引用
No.9198-8 - 2020/10/08 (木) 10:53:15 - G25
今さらのコメントかもしれませんが、

レプリケートの作り方で、
操作のどこまでがレプリケートごとに個別で、どこまでが共通なのかがわからないので、ポイントが絞れませんね。

例えば、バラつくと言っているというのは、まったく別の実験機会で、同じサンプルで同じ操作をしたけれど、毎回、結果が異なり再現がとれないということなのか?

それとも同時に行ったレプリケートなのか?
それも、チューブごとに独立した調製なのか、それとも本数分のマスターミックスを作ってレプリケートに分注しているのか(おそらくリアルタイムPCRのtechnical replicateで一般的なのはこうだと思いますけど)。

(無題) 削除/引用
No.9198-7 - 2020/10/08 (木) 09:08:57 - aa
手技の問題なら電動ピペットを使えばある程度は改善するんじゃないでしょうか

もし機械の故障が疑われるなら一度メーカーさんにみてもらうのもありかと

校正の証明付かないのならそこそこのお値段でできたような

ダメそうなwellの場所がわかるならそこを外してやればなんとかなるようなきもするけど

(無題) 削除/引用
No.9198-6 - 2020/10/06 (火) 08:48:27 - ぽー
同じ研究室の人に同じサンプル、同じプライマー、同じwellの位置でqPCRをしてもらもらうのはどうでしょうか?
他の人でも同様にぶれるのであれば、プライマーと機器の相性とかを考えなくてはいけないかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.9198-5 - 2020/10/06 (火) 02:05:22 - おお
ばらつきが大きいとおっしゃいますが、主観的な記述なので実際どれくらいか提示したほうがいいのでは?
PCRマシーンのWellの位置によって温度がばらつく場合はメーカーに言ってcalibrationし直したほうがいいとか言う話は昔よく聞いたけど、特定の位置で固有のぶれ方するとかないでしょうか?必要なものをすべてMixした上で分注して測定してばらつきが出るなら、測定機の可能性も考えていいかもです。シールがちゃんとできているかというのも気になりますね。

(無題) 削除/引用
No.9198-4 - 2020/10/06 (火) 01:14:04 - flower
>BlueComma様
ピペッティングの際、チップの先端から吸引した溶液の液面までの距離が毎回同じになっているかを確認するようにはしていますが、チップを入れる際の深さは気にしたことがありませんでした。この点も気を付けてもう一度試してみます。ありがとうございます。

>まっくろん様
現在は、cDNAとプライマー以外の溶液を混合して分注するようにしています
一度、cDNAも含めて混合して、自動分注機を使って試してみようと思います。
またウェルの場所によっても問題が生じる可能性があるとは知りませんでした。こちらも確かめてみます、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.9198-3 - 2020/10/05 (月) 23:41:34 - BlueComma
ピペットマンの操作に問題はないということですが、テンプレートの吸引時の操作はいかがでしょうか?

以前、チップの先端をDNA溶液の深くまで入れてしまうと、溶液に浸かった部分にDNAが付着するのでバラツキが出やすいと教わったことがあります。私自身、テンプレートを加える時は液の際でのピペッティングに特に注意しており、倍近くバラツキが出るようなことは起こっていません。

(無題) 削除/引用
No.9198-2 - 2020/10/05 (月) 17:24:16 - まっくろん
 こういったトラブルは大変イライラしますよね。

 記載されている誤差は全てを混和した溶液をディスペンサー(連続分注機)で添加しても起こりますか?もし起こるようでしたら,ピペッティングなど手技以外の問題である気がします(現時点でもそう言えるかもしれませんが)。添加するウェルの位置はどうでしょうか?私は,シールの問題なのかプレート外側のウェルで結果が安定しないことを経験したことがあって,そこを使わないようになりました(なので実質6x10ウェルしか測定出来ない)。また,他の方は問題なく出来ているということですが,機器自体のチェック可能性として必要かもしれません。

qRT-PCRの同一サンプルでの誤差 削除/引用
No.9198-1 - 2020/10/05 (月) 16:49:17 - flower
お世話になっております。
qRT-PCRを最近やり始めたのですが、同一のテンプレートを使用しているのにも関わらず、発現量が倍近くずれて計算されてしまい、困っています。

使用機器はStepOnePlus (Thermo)
使用試薬はTHUNDERBIRD SYBR qPCR mix (東洋紡)
PCRチューブ含め、試薬以外はすべて純正品を使用しています。
また、テンプレートcDNAはReverTra Ace(東洋紡)を使用しています。
研究室内の他の人も同じ試薬を使用していますが、特に問題なく実験できているようです。

プライマーはオリジナルで設計し、ΔCt値がすべて同じになるかどうかを確かめるためにcDNA濃度を振って試したのですが、あまりにばらつきが大きいためそもそも同じテンプレートで同じように増えるのかを確かめようとしたら、同じテンプレートでもばらついてしまい、こちらで質問するに至りました。

使用している機器・試薬はROX補正付きのもので、少なくとも見た目にはピペッティングミスによる液量差は見られません。
また使用しているピペットマンは、年度初めに自分でRO水を測り取り質量を測ることで、目的量がきちんととれていることを確認しています(もちろん目安程度にしかならないとは思いますが)。
メルトカーブを確認する限り、プライマーダイマーは生じていません。またテンプレートなしのコントロールでの増幅は見られませんでした。
ピペットマンは他の実験でも使用していますが、チップ・滅菌水はPCR専用のものを用意して使うようにしています。

原因としてどのようなことが考えられるでしょうか?
また、自分の手腕のミスであるとすれば、他にどのような点に気を付ければよいでしょうか?

どうぞよろしくお願いいたします。

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