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蛍光タグの違いでタンパクの発現量が変わるのでしょうか トピック削除
No.9236-TOPIC - 2020/10/19 (月) 16:42:44 - ひやま
タンパク質にYFPやGFP,RFPを融合したプラスミドを作製し、細胞に導入して局在やタンパク質発現量等を観察しています。
あるタンパク質に関しては、RFPのタグをつけたプラスミドを細胞にて発現させた時とGFPのタグをつけたプラスミドを細胞にて発現させた時では、明らかに融合したタンパク質の発現量が異なりました。
ベクターや融合した際の制限酵素やリンカー等、また培養細胞の条件は同じです。
RFPやGFP等の蛍光タグの種類によって、このようなことはよく起こることなのでしょうか？
初めてのことで、原因が分からずにいます。
みなさまご教授していただけると、ありがたいです。
　
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(無題) 解決済み 削除/引用
No.9236-8 - 2020/10/21 (水) 19:40:50 - ひやま
＞とおりすがりのもの様
ありがとうございます！
mCherry-GFP-LC3 アッセイ等、確認してみます。

＞おお様
おっしゃる通りです。
蛍光強度からでは定量はできませんので、今回はGFP等で発現を確認しましたが（今後WB等で詳しく確認する予定です）、あまりにタグの違いで差があったものですから質問させていただきました。
ありがとうございます。


みなさま
ありがとうございました！

(無題) 削除/引用
No.9236-7 - 2020/10/20 (火) 19:52:35 - おお
>[Re:5] ひやまさんは書きました :

> ＞おお様
> 発現量は、蛍光観察したものを輝度を数値化して確認しています。

輝度から、どのように蛋白の質量に変換しているのですか？輝度から単純にどっちが多いとか少ないとか言えないと思いますが。

(無題) 削除/引用
No.9236-6 - 2020/10/20 (火) 18:48:38 - とおりすがりのもの
>細胞の培養環境によって最適なタグにした方が良いということですね。

いいえ、
酸性オルガネラなどではGFPは消光すると言いたかったです。
言葉足らずで申し訳ありません。

この仕組みを利用して オートファジーの
mCherry-GFP-LC3 アッセイなどが行われているのは有名だと思います。

(無題) 削除/引用
No.9236-5 - 2020/10/20 (火) 18:20:54 - ひやま
みなさま　
ご助言ありがとうございます。

＞G25様
タグによって分解のされやすさ等も異なるんですね。
考慮できていませんでした、ありがとうございます。

＞とおりすがりのもの様
細胞の培養環境によって最適なタグにした方が良いということですね。
ありがとうございます！

＞おお様
発現量は、蛍光観察したものを輝度を数値化して確認しています。

(無題) 削除/引用
No.9236-4 - 2020/10/20 (火) 09:51:38 - おお
確認ですが発現量はウエスタンブロッティングで確認したのですか？

(無題) 削除/引用
No.9236-3 - 2020/10/20 (火) 08:04:12 - とおりすがりのもの
コドン頻度の影響もあると思いますし、成熟時間の問題もあると思います。

それぞれのターンオーバーも違うでしょうし、GFPは酸性条件下で消光するので、検出系に影響してくる可能性もあるとおもいます。

蛍光で見ているのでしたら本当に正しい局在をとっているかも注意が必要かもしれません。(ダイマーでおかしくなっているとか)

(無題) 削除/引用
No.9236-2 - 2020/10/19 (月) 17:45:47 - G25
コドンの偏りによる翻訳速度の問題もあるだろうし、サイズなんかも違うんじゃない？
YFPはGFPの派生体で基本構造は同じはずだけれど、RFP（サンゴ由来　DsRed）は全く別物だし。寿命（分解されやすさ）なんかも違ったはず。

蛍光タグの違いでタンパクの発現量が変わるのでしょうか 削除/引用
No.9236-1 - 2020/10/19 (月) 16:42:44 - ひやま
タンパク質にYFPやGFP,RFPを融合したプラスミドを作製し、細胞に導入して局在やタンパク質発現量等を観察しています。
あるタンパク質に関しては、RFPのタグをつけたプラスミドを細胞にて発現させた時とGFPのタグをつけたプラスミドを細胞にて発現させた時では、明らかに融合したタンパク質の発現量が異なりました。
ベクターや融合した際の制限酵素やリンカー等、また培養細胞の条件は同じです。
RFPやGFP等の蛍光タグの種類によって、このようなことはよく起こることなのでしょうか？
初めてのことで、原因が分からずにいます。
みなさまご教授していただけると、ありがたいです。
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