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(無題) 削除/引用 No.93-12 - 2018/05/27 (日) 22:34:04 - おお >不死化B細胞株などのリンパ球のsingle cell cloningを行う場合は、浮遊細胞のため培地交換などはどのように行うのがよろしいのでしょうか。 そのような細胞は扱ってませんが、細胞が非常に少ないうちはあまり培地を更新する必要性を感じません。増殖スピードにもよるでしょうけど、１週間ぐらい培地を変えず放置で、ある程度増えてきたら懸濁した状態で一回り大きいプレートなどに全量入れて更に新しい培地を加えて、増殖させるとかして、遠心して細胞を回収できるスケールまでに持っていけばいいのかなという気がします。細胞によってはそういう継代が不適切７日もしれませんが、具体的にそういう話はあまり聞きません。

(無題) 削除/引用 No.93-11 - 2018/05/27 (日) 14:01:51 - gys >リンパ球のsingle cell cloningを行う場合は、浮遊細胞のため培地交換などはどのように行うのがよろしいのでしょうか。 遠心で細胞をペレットにして、上清を破棄、新しいメディウムを加えるがよいと思います。 細胞数が極端に少ないと死滅してしまうとの意味でしょうか。 それでしたら、古い上清を半量ほど残してあげるとよいと思います。 （コンディション培地）

(無題) 削除/引用 No.93-10 - 2018/05/26 (土) 20:47:01 - awsdefrgty 1ウェルあたり１個とか計算しても実際にはそうならない。1ウェルあたり10個でも数十から数個or0個とかなりばらつく。なので、倍々希釈で希釈いくと、最後の方はウェルは1~5くらいになるとおもう。数のすくないwellは播種当日はあるのかないのかよくわからないけど、１〜２日してコロニアルグロース始めるとわかる。とりあえずコロニー数１〜4個のwellは印つけておく。2~4コロニーのwellは増殖させてからまた倍倍希釈してまく。

single cell cloning 削除/引用 No.93-9 - 2018/05/25 (金) 16:23:16 - Akki single cell cloningに関して基本的なことですがお伺いしたいことがあります。 不死化B細胞株などのリンパ球のsingle cell cloningを行う場合は、浮遊細胞のため培地交換などはどのように行うのがよろしいのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.93-8 - 2012/02/07 (火) 09:27:51 - ~ 読み返したら、1 cell/wellでは非選択条件でも増えない話ではなく、選択により除かれる細胞も一緒に撒き込む話だったのですね。 薬剤選択した後のシングルセルアイソレーションと、選択前に1ウェルに複数個の細胞を撒くことで生じるそれぞれのリスクは、 前者が同じクローン由来の複数のシングルクローンを複数を拾うリスクが生じ、後者が複数のクローンの混合物を拾うリスクが生じることでしょう。 両方のリスクをなくしたいのであれば、、複数バッチの遺伝子導入を行い、それぞれの薬剤選択後に１つずつシングルクローンを得ることで、異なる由来のシングルクローンを得ることが出来るでしょう。 多くの遺伝子導入試薬はスケールダウンが出来ますので、そこまでコスト高にはならないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.93-7 - 2012/02/07 (火) 04:53:24 - モモ 私の場合は遺伝子導入の効率とばらつきによって大体の目安を決め、そこに安全率をどの程度考慮するかで決めてます。なので、細胞によって１個以下にするときもあれば、２００個ぐらいのときもあります。 薬剤選択を先にするのはお勧めしません。

(無題) 削除/引用 No.93-6 - 2012/02/01 (水) 08:48:37 - ~ 細胞によっては薄撒きに弱く、1個以下/wellの頻度では生えない場合もあります。 その場合は、コンディションドメディウムを使うと改善するかもしれません。 頻度だけが問題であれば、384well plateであれば、1枚あたりの処理数を4倍に増やせます。（分注装置が無いとメリットが薄いですが）

(無題) 削除/引用 No.93-5 - 2012/01/27 (金) 19:31:55 - 774 増殖したら通常通り継代すれば大丈夫です。 死にかけの耐性のない細胞の排除にもなる印象です。

ありがとうございます 削除/引用 No.93-4 - 2012/01/27 (金) 18:38:26 - クローニング苦労人 774さま，KYさま アドバイス有難うございます。 薬剤セレクション後に限界希釈ということであれば，確かに1個以下/wellで良いのかもしれませんね。参考になります。 ただ，トランスフェクションする際には，サブコンフルエントな状態で実施予定です。したがって，そのまま薬剤セレクションすると，死んだ細胞が生えていた領域に，トランスフェクトされた細胞が再び増殖することになりますよね。根拠は無いのですが，なんとなく，気持ち悪い気もします（科学的考察で無く，お恥ずかしい・・・）。 いずれにしても，アドバイス頂いた方法でも実施してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.93-3 - 2012/01/27 (金) 17:22:47 - KY おそらく、そのプロトコールは経験的に作成されたものなのだと思います。なので、薬剤やトランスフェクション方法、細胞が違えば、それに合わせて効率のよい方法をとればいいのだと思います。 苦労人さんがまったく同じ条件でクローニングしているのであれば、それに従うことがラボとしてはよいかも？ ただ、確実なクローニングという意味では1以下個/wellにするべきだとは思いますが。 もしくはセレクション修了直後に1以下個/wellで撒けばよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.93-2 - 2012/01/27 (金) 17:21:24 - 774 先に薬剤セレクションして、生き残った細胞を限界希釈してみてはどうでしょう？ 薬剤の濃度次第ではありますが、数日から１週間の遅れで済むと思います。

安定発現株樹立のための限界希釈法について 削除/引用 No.93-1 - 2012/01/27 (金) 10:13:36 - クローニング苦労人 基本的な事ですが，皆様のご意見をお聞きしたく投稿しました。安定発現細胞株を樹立する予定で，試験計画を立てています。近くの熟練者に教えて頂いた方法では，最薄で10 cells/wellで細胞を撒き，コロニーを得るとの事でした。薬剤耐性をマーカーに生き残る細胞を得るわけですから，10個中1個くらいの確率だと想定した方法なのだと自分なりに理解しました。しかし，ネット検索した結果では，wellあたり1個以下(0.3-0.5)に調整して撒くと書かれているものが多いです。シングルクローンである確率を上げるには元の細胞数が少ない方が良いというのは理解できますが，1個以下で撒くと，コロニーが得られる確率は極めて低いと思うのです。実際に試せば良い事ですし，その予定ではありますが，多くの方は，やはり1個以下/wellの条件で実施しているのでしょうか？

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