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ペプチドを免疫染色する方法 トピック削除
No.9323-TOPIC - 2020/11/21 (土) 08:33:36 - ttt
合成したペプチドに、手元にある免染用の抗体が反応できることを確認したいと思っています。おり、どのような方法がよいか検討しているところです。
思いつくのはウエスタン・ブロッティング(SDS-Pageで泳動→メンブレンにブロッティング→免染)を行ってバンドの化学発光の程度を定量化する方法ではないかと考えているのですが、
今回の場合、ペプチドの分子量などは既知で、すでに精製されているので、本来なら最初の泳動で分離する作業工程は不要です。いきなり、メンブレンにペプチドを固定して染色するような方法があればいいなと思っているのですが。
ペプチドへの免染抗体の結合能を示す方法としてはどのようなものが適しているでしょうか?
あまり予算もないので、ビアコアのような高価な機器や試薬を使わずに行ける方法を探しています。
ご教示お願いいたします。
 
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(無題) 削除/引用
No.9323-7 - 2020/11/24 (火) 16:44:47 - ttt

> 膜への保持効率はペプチドの疎水性/親水性、分子量に依存します。

分子量は2300 g/mol前後で、疎水性/親水性の比率は単純に分けると90%以上が親水性のアミノ酸で構成されていて、塩基性アミノ酸(正電荷)が比較的多く含まれる配列です。
親水性が強いのでPDVFやニトロセルロース膜ではやはり結合能は低いでしょうか?それともわずかでも疎水性の配列が入っていれば、ある程度の結合は期待できますでしょうか?
他に代替になるような膜はありますでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.9323-6 - 2020/11/21 (土) 22:03:55 - ttt
いくつか方法を教示いただき、ありがとうございます。

実験の規模としてはそこまで大きくないので、まずはドットブロットで試してみようかと思います。
実験系が大きくなるようならマイクロプレートに固相化してみようと思います。

(無題) 削除/引用
No.9323-5 - 2020/11/21 (土) 17:07:43 - 凸
そういった目的用に、ペプチドなどを共有結合で固相化できるELISAplateがkitとして売ってますので、それを使ってELISA 系を組めばよいと思います。Peptide coating kit , ELISAなどで検索すればいくつか見つけられます。

(無題) 削除/引用
No.9323-4 - 2020/11/21 (土) 15:51:36 - あの
当該抗体を固相化、ではなく

第2抗体をマイクロプレートに固相化の方がよいですね。

続いて当該抗体をウェルにいれ
ペプチドをビオチン標識してウェルにいれ
HRPと適当な基質で発色するかどうか確認

可能ならEIA的なこともしてスタンダードカーブ書けるか確認

(無題) 削除/引用
No.9323-3 - 2020/11/21 (土) 15:46:15 - あの

当該抗体をマイクロプレートに固相化
ペプチドをビオチン標識してウェルにいれ
HRPと適当な基質で発色するかどうか確認

可能ならEIA的なこともしてスタンダードカーブ書けるか確認

(無題) 削除/引用
No.9323-2 - 2020/11/21 (土) 08:43:05 - Tracker
>メンブレンにペプチドを固定して染色
ドットブロットですね。ドットブロット用の装置もありますがマニュアルでPVDFにスポットする、というのも可能です。
膜への保持効率はペプチドの疎水性/親水性、分子量に依存します。
あるいは、maxisorpのような高吸着プレートに固相化して、ELISA的に検出する、という方法もあります。
結合能を示すだけなら上記の方法で問題ないと思いますが、結合特異性を示すためのスクランブルペプチドとかはネガコンとしてセットした方がいいかもしれません。
一応、いずれの方法も免疫染色でワークすることを保証する実験ではないことにご留意ください。

ペプチドを免疫染色する方法 削除/引用
No.9323-1 - 2020/11/21 (土) 08:33:36 - ttt
合成したペプチドに、手元にある免染用の抗体が反応できることを確認したいと思っています。おり、どのような方法がよいか検討しているところです。
思いつくのはウエスタン・ブロッティング(SDS-Pageで泳動→メンブレンにブロッティング→免染)を行ってバンドの化学発光の程度を定量化する方法ではないかと考えているのですが、
今回の場合、ペプチドの分子量などは既知で、すでに精製されているので、本来なら最初の泳動で分離する作業工程は不要です。いきなり、メンブレンにペプチドを固定して染色するような方法があればいいなと思っているのですが。
ペプチドへの免染抗体の結合能を示す方法としてはどのようなものが適しているでしょうか?
あまり予算もないので、ビアコアのような高価な機器や試薬を使わずに行ける方法を探しています。
ご教示お願いいたします。

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