Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る | トピック一覧 | 研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム(readのみ)

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

制限酵素処理によるメチル化解析について トピック削除
No.9333-TOPIC - 2020/11/24 (火) 16:42:53 - 初心者
はじめまして、メチル化の解析を始めたばかりのものです。

とある遺伝子のメチル化を評価するため、制限酵素(MspI)処理したものとDWで処理したものを制限酵素部位を挟んだrealtimePCRを設計し、2^-{<MspIのCt>-<DWのCt>}x100という式でメチル化の%を計算する方法をとっています。
(過去の同様な文献を参照しました)

その結果、メチル化が20%や50%という結果がでているのですが、時々200%といった100%を超える結果が出てしまいます。
(要するに制限酵素処理したサンプルのCt値がDWでのCt値を下回る)

これはどう解釈していいか、ご意見を頂けませんでしょうか。
100%を超えるものは単純に100%メチル化していると考えればよいのか、それともHyperメチレーションというものなのか、手技の問題ないの、ご教授いただけませんでしょうか。
 
- このトピックにメッセージを投稿する -



4件 ( 1 〜 4 )  前 | 次  1/ 1. /1


(無題) 削除/引用
No.9333-4 - 2020/11/25 (水) 08:30:38 - 初心者
おお様

ありがとうございます。
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32102481/
Detection of LINE-1 hypomethylation in cfDNA of Esophageal Adenocarcinoma Patients

こちらの文献を参考にしています。
コメントお願い致します。

(無題) 削除/引用
No.9333-3 - 2020/11/25 (水) 07:20:36 - おお
>[Re:2] おおさんは書きました :

> 2^-{<MspIのCt>-<DWのCt>}はFold changeで直線的な割合としての%を見ることにはなりません。
>

あ、ごめんなさい二倍になったら200%となるわけだから%表示がおかしいわけではありませんでしたこの部分は訂正します。

(無題) 削除/引用
No.9333-2 - 2020/11/25 (水) 04:13:14 - おお
突っ込みどころが満載ですが、
MspIはメチレーションの影響を受けませんので、その実験はメチレーションを見れません。

2^-{<MspIのCt>-<DWのCt>}はFold changeで直線的な割合としての%を見ることにはなりません。

そのうえで確かにコントロールのCt値が大きくなり100を超えることは理論上ありえないので実験上の(避けられるか避けられないかはおいといて)エラーだと思います。制限酵素処理によりかかりやすくなったりとかまあありそうな気もしますので。200%と言う事ならそれはそれぐらいの誤差は生じるだろうということを念頭に、じっさいは100%の解釈でいいと思います(ただしすでに述べたようにFold changeは直接割合として示せません)。

読んだ文献を明示していただけませんか?

制限酵素処理によるメチル化解析について 削除/引用
No.9333-1 - 2020/11/24 (火) 16:42:53 - 初心者
はじめまして、メチル化の解析を始めたばかりのものです。

とある遺伝子のメチル化を評価するため、制限酵素(MspI)処理したものとDWで処理したものを制限酵素部位を挟んだrealtimePCRを設計し、2^-{<MspIのCt>-<DWのCt>}x100という式でメチル化の%を計算する方法をとっています。
(過去の同様な文献を参照しました)

その結果、メチル化が20%や50%という結果がでているのですが、時々200%といった100%を超える結果が出てしまいます。
(要するに制限酵素処理したサンプルのCt値がDWでのCt値を下回る)

これはどう解釈していいか、ご意見を頂けませんでしょうか。
100%を超えるものは単純に100%メチル化していると考えればよいのか、それともHyperメチレーションというものなのか、手技の問題ないの、ご教授いただけませんでしょうか。

4件 ( 1 〜 4 )  前 | 次  1/ 1. /1


パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール   アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存(次回の入力の手間を省けます)
上に上げない(トピックの一覧で一番上に移動させません)
解決(問題が解決した際にチェックしてください)
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 

〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。