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(無題) 削除/引用 No.9334-26 - 2020/11/26 (木) 17:19:57 - おお ちなみに私も大腸菌発現系で非常に増殖が遅いクローンとか経験があります。なので場合によっては質問に書かれているようなことが起こっても不思議ではないと思っています。 G25さんがほとんどの対処方法をカバーしてますが、あえてちょっと乱暴な方法を書いておきます。 大腸菌とか液体よりプレートのほうが増殖しやすいようで、コロニーを拾ったら１００ulぐらいの培地に懸濁して、場合によってはしばらく培養してから、その培養液をプレートに塗り込んでください。通常よく増える場合は数時間で薄っすらと全体を菌が覆うようになります。今回の場合どれくらいの時間で増えるかはわかりませんが、増えてきたら１ー２mlぐらいの培地をプレートにかけて、Cell spreaderなどで菌を懸濁して液体培地を回収して、誘導をかける。 プレートの培養はある程度増えると死菌が多くなってきますがそのへんの加減をうまく伝えれませんが、 てかあまり初心者にやらせるようなやり方ではないか、、、、

(無題) 削除/引用 No.9334-25 - 2020/11/26 (木) 11:07:20 - G25 いろいろ出てきた情報を考え合わせると、導入遺伝子のleaky expressionnによる毒性の問題の可能性が高いと見ました。だとしたら初心者がやるには荷が勝ちすぎだったかも。同じことを材料を変えてやり直しても同じ結果になるでしょう。 プラスミドのintactness確認しろとは言いましたが、それはそれくらい押さえておくべきだろうということであって、それが原因という疑いが濃かったわけではありませんん。99.999％以上分解していても形質転換には十分でしょう。ましてやフリーザー凍結保存していたなそれほど分解するものでもない。 先人の情報でもコロニーが生えるのに異常に長時間かかる、ピックアップしたコロニーが液体培養で増えてこないなんてのは、毒性のある時の典型的症状です。leaky expressionの問題はポピュラーであり、探せば対処法の記載はたくさん見つかるでしょう。 助言としては、 ・宿主をpLysSを持つ系統にスイッチする（BL21(DE3)pLysS)。lysozymeがleakなT7 RNA polを阻害してくれます。 ・培地にグルコースを加える。lacIとは別の系でlac proを抑制します。 ・培養温度を下げる。このベクターは違いますがpUC系oriならコピー数を下げることができます。そうでなくても、タンパク質の発現を緩やかにすることで毒性から逃れられる可能性があります。誘導をかけて大量発発現するときも封入体化を避けるためなどで温度を下げて培養することはよく行われます。

(無題) 削除/引用 No.9334-24 - 2020/11/26 (木) 10:37:23 - G25 あ、EX1見ていたわ。EX2はoriを入れ替えてあるんんですね。

(無題) 削除/引用 No.9334-23 - 2020/11/26 (木) 10:34:40 - G25 >[Re:21] おおさんは書きました : > >[Re:16] G25さんは書きました : > > > > > > 大抵の発現ベクターはleaky expressionで発現量が高くならないように、わざとlow copy のrepliconにしてあることがおおいけれど、このベクターは違うようだ。 > > pALTER-EX2を使っていると訂正が入る前の話で進んでるような気もしますが、このベクターp１５A Oriを使っていてLow Copyのようです。 > そうでしたか。ネットで調べるとoriに関する情報が空白だったりするのが多かったんですが、pUC oriと書いてあるのが一つあったので。

(無題) 削除/引用 No.9334-22 - 2020/11/26 (木) 10:02:37 - おお >[Re:20] iiさんは書きました : > スレ主は初心者だと言いながら、トランスフォーメーションのプロトコルはスタンダードな方法に従っていないし、 ConstructionをしてないならカルシウムによるTransformationは十分スタンダードになりえます。

(無題) 削除/引用 No.9334-21 - 2020/11/26 (木) 10:00:34 - おお >[Re:16] G25さんは書きました : > > 大抵の発現ベクターはleaky expressionで発現量が高くならないように、わざとlow copy のrepliconにしてあることがおおいけれど、このベクターは違うようだ。 pALTER-EX2を使っていると訂正が入る前の話で進んでるような気もしますが、このベクターp１５A Oriを使っていてLow Copyのようです。

(無題) 削除/引用 No.9334-20 - 2020/11/26 (木) 07:13:31 - ii トラブルシューティングの基本はとにかくガッチガチに堅実な条件から始めることだと思っているので、とにかく信頼できるポジコンのプラスミドと、高効率が保証されている市販のコンピテントセルを買ってきて、最もスタンダード (高効率) な手法でちゃんとコロニーが生えることの確認から始めたほうがいいと思う。 スレ主は初心者だと言いながら、トランスフォーメーションのプロトコルはスタンダードな方法に従っていないし、トランスフォーメーションを上手くできないと言っている者が作ったコンピテントセルが果たしてちゃんと機能するのかも疑問だ。

(無題) 削除/引用 No.9334-19 - 2020/11/26 (木) 05:44:58 - おお >[Re:18] 限界集落さんは書きました : > > おおさん-コロニー拾って簡単に調べる等 > ありがとうございます。発現誘導はIPTGで、プラスミドは論文でこのタンパク質作った先生に分けてもらったそうで、古さを除けば大丈夫なのかなあと思っています。生物実験初心者なので、コロニー拾って簡単に調べる具体的な方法を示してほしいです。自分が考えたのは液培で増やしてIPTG入れて前後のたんぱく発現量を比較する、だけです。現状15hで増えてないのでまた明日かなあと思っていますが、簡単に調べる方法がほかにもあれば、教えていただきたいです。返信お待ちしています。 培養のスケールはどのくらいですか？ ml単位で培養しているなら遠心して回収して１００ｕlぐらいに懸濁してください。２５ｕlほどは分注して今後の実験ように４度保存しておいて、のこりで濁度が明らかに認められるならIPTGで誘導して遠心で回収、LysisしてSDSPAGEにながせばいいかと思います。懸濁が認められないくらいならそのスケールで培養すればいいです。できれば同程度のタンパク量のネガコンをおいて、CBBとか総蛋白量で見れるほどでないのならWBで発現を確認してください。 そのタンパク質は酵母などで発現しているものですか？ 長時間のプレートでの培養では酵母が増殖している可能性があるので判断ができないなら仕方ないですが、そのへんは経験がありセンスある人がいないとなんともなりません。

(無題) 削除/引用 No.9334-18 - 2020/11/26 (木) 01:25:59 - 限界集落 多くの返事をいただきありがとうございます。 皆様に提案いただいたように、再度、回復培養を長く、コンピセル及びプラスミドも多くしてみてトラフォメしてみようと思います。コンピセルはストックがないので来週つくることにしたので今回はここで終わりとさせていただきます。ちなInoue法です。 現状報告 とりあえず生えたコロニーをようじで突っついて5 mLで振ってみました。振ってみたのはコンピがないのでトラフォメやり直せない、かつ先生は、できるんじゃない？と言い、菌が増えたらプラスミド入ってると考えたためとりあえずやってみました。現在15時間経過しましたが、コロニーつついていないコントロールと比べて見た目増えていません。 実験条件等 今回の実験プロトコルは、購入したコンピセル(ニッポンジーン ECOS TM)のサイトに記載されていたプロトコルそのままです。 菌株の種類などは何年も前の先輩方も行っていた通りですが、肝心なプロトコルが伝わってきていません。そのため(以下略。 指摘された問題点と自分の疑問 G25さん-プラスミドが死んでいる可能性がある(具体的にどのように壊れたかはわからない) ご指摘ありがとうございます。プラスミドが死んでいるのなら36h後の寒天培地上で生育したコロニーは何で生えてきたのか、とも思いました。この理由は、寒天に撒いたとき、プラスミドが入っていたものの、回復培養が足りないためコロニー形成まで時間がかかってしまったと考えました。すると、プラスミドが死んでいるというように素直に考えられなくて、自分センスないんですかね... おおさん-コロニー拾って簡単に調べる等 ありがとうございます。発現誘導はIPTGで、プラスミドは論文でこのタンパク質作った先生に分けてもらったそうで、古さを除けば大丈夫なのかなあと思っています。生物実験初心者なので、コロニー拾って簡単に調べる具体的な方法を示してほしいです。自分が考えたのは液培で増やしてIPTG入れて前後のたんぱく発現量を比較する、だけです。現状15hで増えてないのでまた明日かなあと思っていますが、簡単に調べる方法がほかにもあれば、教えていただきたいです。返信お待ちしています。 G25さん-抗生物質の半減期 液培は抗生物質が次第に減る、半減期はおよそ8h, ということを先輩から聞きました。寒天はエアレーションないからへたらないのでしょうか。こちらは自分で勉強してみます。ご指摘ありがとうございます。 最後になりますが、ラボだけではこんなにたくさんの意見に触れ合うことがないので、良い経験となりました。皆様ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9334-17 - 2020/11/25 (水) 17:43:04 - G25 あと気になったんだけれど、テトラサイクリンの半減期ってなんだ？ それは、人体に投与したときに生体内半減期のことじゃないか？　肝臓やらなんやらに代謝されたり、排出されたりする状況の話じゃ？ 選択培地中の抗生物質は培養温度に置いておいても、数日以上生きてると思うけどな。耐性菌が生えている場合、その周りのアンピシリンは急激にへたるけど。

(無題) 削除/引用 No.9334-16 - 2020/11/25 (水) 17:32:25 - G25 そのコンストラクトとBL21(DE3)の組み合わせは、先人の実績があるんですよね？ だったらあまり言うことないけれど、実は今回、BL21(DE3)を初めて使いました、なんてことなら、いろいろ考えるところはある。 とくに発現ベクターの場合、リーキーな産物が毒性のため大腸菌が生えてこないということがよくある。 leaky expressionはどれほど厳密に抑制されるか、 発現させる遺伝子産物が大腸菌の毒性を示さないかどうか、 とか、 大抵の発現ベクターはleaky expressionで発現量が高くならないように、わざとlow copy のrepliconにしてあることがおおいけれど、このベクターは違うようだ。 大抵の発現ベクターはlacIqが乗っていて、宿主のlacIを強化しているけれどこのベクターはそうじゃない。 毒性が疑われて生えてこないときは、まず30度以下に培養温度を下げてみるのが有効。室温とか18 ℃とか。

(無題) 削除/引用 No.9334-15 - 2020/11/25 (水) 17:18:29 - G25 まず、新たにライゲーションしてと形質転換体をとるてんじゃなくて、もう完成したプラスミドコンストラクトを精製したもので形質転換するんだから、形質転換効率が低いコンピだって構わない。 仮に10^4cuf/ugプラスミドだとしても1 ng入れたら数十個は生えてくる計算だから。市販品だし、普通は保存状態が悪くてもそこまで落ちないけどね。あるとすれば、なにかの事故で全く死んでるか。 まず、疑うべきはプラスミドの品質だけれど、泳動してチェックしてみた？　真っ先にやるべきことのはず。 100 ng/uLで保存してたっておかしかないや。常識の範囲だし、それで薄いとかなんとか文句言われる筋合いもない。確かに濃いほうが安定に保存できるけれど、薄いからと言って形質転換で使い物にならなくなるくらい劣化するとは考えにくい。劣化、分解があるなら理由は別にあるだろう。 テトラサイクリンはアンピシリンと違ってタンパク質合成阻害の抗生物質なので、回復培養は十分時間を取ったほうがいい（一時間くらい）。 アンピシリンは細胞壁合成の阻害をするだけだから、βラクタマーゼが十分に発現していない状態で見切り発車で選択培地にまこうが、あとからでも発現してくる。しかし、見切り発車でタンパク質合成が阻害されたら、そのあと耐性遺伝子のタンパク質産物もできない。

(無題) 削除/引用 No.9334-13 - 2020/11/25 (水) 15:55:48 - み 36時間で出てきたコロニーは駄目だろうな。 回復培養30minは短いかも。 60以上場合によっては90minとかやってみたら。 BL21は効率悪いしコンピけちらずに多めのvolime使った方が良い。

(無題) 削除/引用 No.9334-12 - 2020/11/25 (水) 13:40:18 - おお >[Re:9] 限界集落さんは書きました : > ご回答いただいた皆様ありがとうございます。迅速な返事感謝いたします。 > > 現状報告しますと、36時間目でコロニーが出現しました。 > T7プロモーターがついているので大量発現できるはずです。抗生物質も同様です。 > https://www.addgene.org/vector-database/1722/ これってIPTGなどで誘導するタイプではないように見えますが、そうすると（じっさいは場合によってはそうであっても）発現している蛋白のため増殖が抑制されているかもしれません。コロニーを拾ってかんたんに調べてみてもいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.9334-11 - 2020/11/25 (水) 13:31:40 - SYBR master >[Re:9] 限界集落さんは書きました : > 現状報告しますと、36時間目でコロニーが出現しました。 > ただ、抗生物質の半減期が8時間で、一応暗所で培養したのですが、トラフォメがうまくできているか判断しかねています。ご意見をお願いいたします。 私なら信用しません。 > おおさん、ご指摘ありがとうございます。コンピは100 uLを10 uL毎10本に、氷上で分注しました。そこで一回再凍結したと考えていますが、それ以外はありません。さらにご指摘のようにプラスミドを電気泳動で確認してみます。K株は持ってないです。 BL21系のケミカルコンピは、基本的に高くても10^6 cfuしか効率が出ません。それを凍結融解した場合、効率はさらに低下していると思われます。また市販品のコンピとのことですが、近年有名メーカーでは無い所から出回っているコンピは安価ですが、添付のデータシートの効率は出ないことが多いです。この場合、多量のplasmidを投入することで解決できますので、試してみてください。ちなみに出入りしている院生用に先日購入したBL21(DE3)は、たぶん10^4cfuしか無かったです。仕方ないのでマイクログラムにいplasmidを投入して、100個ほどのコロニーでした。 > 追加でお聞きしたいことがあります。本来の目的に戻りますが、発現精製したい目的タンパク質はdimerで、当ラボの従来法では再度コンピ化して2つ目のプラスミドをトラフォメします。その時, 0.1 MのCaCl2溶液で菌体を2回洗ってコンピ化するという方法で行うそうです。ラボのやり方を信用できない、かつ、他の方法を知りたいため、皆さんの定法があればお聞かせいただけたら幸いです。 CaCl2法でもHanahanでも構いませんが、基本BL21系はコンピの効率が悪いです。コンピの作成法は低温で培養するInoue法という有名な方法が有りますので、調べて見てください。ちなみに自作した場合、BL21系は10^5 cfuまでしか出たことがありません。

(無題) 削除/引用 No.9334-10 - 2020/11/25 (水) 13:20:50 - おお >[Re:9] 限界集落さんは書きました : > > その時, 0.1 MのCaCl2溶液で菌体を2回洗ってコンピ化するという方法で行うそうです。ラボのやり方を信用できない、かつ、他の方法を知りたいため、皆さんの定法があればお聞かせいただけたら幸いです。 CaCl2では高いCompetencyは得られません。もしそのコンピテントでやるならば１ugほど使ってみてください。 たかい効率を得るためにはルビジウムをよく使われていましたがちょっと高いかと思います。しかしながらMnイオンなどを使う改良法が非常に良く現在ではそういう方法がよく使われていると思います。 https://openwetware.org/wiki/TOP10_chemically_competent_cells

皆様に返信と途中経過報告です 削除/引用 No.9334-9 - 2020/11/25 (水) 11:33:55 - 限界集落 ご回答いただいた皆様ありがとうございます。迅速な返事感謝いたします。 現状報告しますと、36時間目でコロニーが出現しました。 ただ、抗生物質の半減期が8時間で、一応暗所で培養したのですが、トラフォメがうまくできているか判断しかねています。ご意見をお願いいたします。 以下返信です。 ICCさん、実験項を書いてくださりありがとうございます。特に違わないので僕の手技的は問題ないと考えられ、iiさんご指摘の通りポジコンで当研究室の他のベクターを用いてみます。この際、抗生物質はTETが良いですよね？ほかの条件を変えないほうが良いと考えました。 おおさん、ご指摘ありがとうございます。コンピは100 uLを10 uL毎10本に、氷上で分注しました。そこで一回再凍結したと考えていますが、それ以外はありません。さらにご指摘のようにプラスミドを電気泳動で確認してみます。K株は持ってないです。。。 おおさん、ぽーさん、プラスミドの種類ですが、説明不足でした。pAlter-EX2というものを用いており、T7プロモーターがついているので大量発現できるはずです。抗生物質も同様です。 https://www.addgene.org/vector-database/1722/ 自分の勉強不足と説明不足で二度手間になってしまい申し訳ありません。 追加でお聞きしたいことがあります。本来の目的に戻りますが、発現精製したい目的タンパク質はdimerで、当ラボの従来法では再度コンピ化して2つ目のプラスミドをトラフォメします。その時, 0.1 MのCaCl2溶液で菌体を2回洗ってコンピ化するという方法で行うそうです。ラボのやり方を信用できない、かつ、他の方法を知りたいため、皆さんの定法があればお聞かせいただけたら幸いです。 続けて返信を下さると嬉しいです。皆さんの実験が進むよう願います。

(無題) 削除/引用 No.9334-8 - 2020/11/25 (水) 10:42:18 - noname プラスミドにテトラサイクリン耐性遺伝子はのっていないですし、 大腸菌もノーマルなBL21(DE3)だとテトラサイクリン耐性はないので生えないです。 コンピテントセルのマニュアルを今一度確認したほうが良いかと思います。 プラスミドの濃度はむしろ濃すぎるくらいかと。。。 その1/1000でも十分です。

(無題) 削除/引用 No.9334-7 - 2020/11/25 (水) 09:05:38 - ぽー プロメガのHPによると、pAlterはクロラムフェニコール耐性になっているため、テトラサイクリンではそもそも増えないだけではないでしょうか？ （テトラサイクリン耐性遺伝子は乗っていない） https://www.promega.jp/products/cloning-and-dna-markers/cloning-vectors-and-kits/palter_max-vector/?catNum=Q5761

(無題) 削除/引用 No.9334-6 - 2020/11/25 (水) 05:05:11 - ii https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ 一回コレに完璧に従ってやってみてください。 またどこかから確実に生きているプラスミドを貰ってきてポジコントして使ってください。

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