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(無題) 削除/引用 No.9336-9 - 2020/11/26 (木) 14:21:15 - qq ＞いやいやもうちょっと低濃度でも測れるでしょう。 まあね、「うまく測れない」という質問だから、マージンを取っただけで、0.5mg/ml程度であれば測れるかなと思います。nanodropのブランクが安定しているのは、なるほど驚くべきことです。 「１mg/mlでA280ODは０.５とか１ぐらい」ですが、nanodropで測定している値は光路長が短いので、その1/10の値を光路で割って1cm当たりに変換しているはずですよね。 nanodropの有利な点は、普通の分光光度計では測れないような濃い試料もそのまま測定できる点だと思います。 だから％吸光係数が大きいDNA（タンパクの10-20倍）の測定には、希釈する必要なく大変重宝しますよね。

(無題) 削除/引用 No.9336-8 - 2020/11/26 (木) 09:50:46 - おお >[Re:7] qqさんは書きました : > nanodropは、光路長（<=1mm）が大変短いので、吸収の強い試料の測定には有効ですが、たんぱく質の測定ではあまりお勧めできないと思います。具体的には、1mg/ml以下のタンパク質だと難しくなるでしょう。普通の分光光度計（光路長1cm）を利用できるのであれば、セミミクロセルを使って測定して、試料を回収するのが良いのではないかと思います。その場合も、緩衝液だけを測定しておくべきでしょう。 いやいやもうちょっと低濃度でも測れるでしょう。１mg/mlでA280ODは０.５とか１ぐらいですし。DNAもODで０.０４ぐらいまでの濃度なら一応測れる事になってますし。 https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/Specification-Sheets/NanoDrop-One-Specifications.pdf Limit of Detectionds DNA Pedestal: 2.0 ng/μL Cuvette: 0.2 ng/μL BSA (IgG) Pedestal: 0.06 (0.03) mg/mL Cuvette: 0.006 (0.003) mg/mL

(無題) 削除/引用 No.9336-7 - 2020/11/26 (木) 09:30:57 - qq ＞抗体などのタンパク質溶液を脱塩処理した後、Nanodrop2000を ＞使ってA280の吸光度測定による濃度測定を行っている 先に出ているTRITONは、透析やゲルろ過などの脱塩処理で除けません。そして大きな紫外吸収を持っています。 タンパク質溶液を作成するときの緩衝液と脱塩に使用する緩衝液とあと蒸留水の吸光度を測定してみて、いずれも大きな吸収がないか調べるとよいと思います。 nanodropは、光路長（<=1mm）が大変短いので、吸収の強い試料の測定には有効ですが、たんぱく質の測定ではあまりお勧めできないと思います。具体的には、1mg/ml以下のタンパク質だと難しくなるでしょう。普通の分光光度計（光路長1cm）を利用できるのであれば、セミミクロセルを使って測定して、試料を回収するのが良いのではないかと思います。その場合も、緩衝液だけを測定しておくべきでしょう。

(無題) 削除/引用 No.9336-6 - 2020/11/26 (木) 05:31:54 - おお ん、抗体を測っているのですね。精製されたこうたいなら２８０nmでの濃度測定は可能なような気がするけど。。。なんだろう。

(無題) 削除/引用 No.9336-5 - 2020/11/26 (木) 02:17:04 - おお あと還元剤なんかも結構邪魔です。

(無題) 削除/引用 No.9336-4 - 2020/11/25 (水) 13:48:11 - おお ２８０nmではかる場合は蛋白以外の夾雑物がないようなときです。またTRITONなど界面活性剤が入っているとその吸収が強いためあまり信用できなくなります。ちゃんと使い分ける必要があると思います。わたしは精製した蛋白の量を２８０nmで測定して測ったことがありますので方法論自体はあります。

(無題) 削除/引用 No.9336-3 - 2020/11/25 (水) 13:22:18 - aaa ありがとうございます。調べてみたところ、Braford法、WST法、Biuret法、Lowry法、BCA法、蛍光法など、色々あるのですね。この中では界面活性剤存在下などの特殊な状況でなければ、お勧めいただいたBraford法が基本の方法になりますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9336-2 - 2020/11/25 (水) 11:56:19 - み bradford法なら速いでしょう。 吸光度による蛋白濃度測定は参考程度にしておいた方が良い。

抗体などのタンパク質の濃度測定 削除/引用 No.9336-1 - 2020/11/25 (水) 10:06:37 - aaa いつも勉強させていただいています。 タンパク質の濃度測定について質問です。抗体などのタンパク質溶液を脱塩処理した後、Nanodrop2000を使ってA280の吸光度測定による濃度測定を行っているのですが、毎回の測定ごとに表示される濃度のバラつきが大きく、どれを信頼していいのか困っています。 測定された濃度をもとに希釈して、そこから先の実験に用いています。例えば同じサンプルで1回目測定が1500μg/mlで2回目が1400μg/mlという程度であればまだ許容範囲ですが、1回目が200μg/mlで2回目が100μg/mlで表示されてしまうと、濃度が2倍違うことになってしまい、どちらを信用していいのか、迷ってしまいます。 しかも、測定回数を重ねるごとにだんだんと低濃度に表示されるようになっていきます。 核酸のときにはこんなにバラつきは大きくない気はするのですが。 やはり、吸光度測定A280でのタンパク質濃度測定は参考程度と考えた方がいいのでしょうか？何か解決策なないかと探しています。 抗体などのタンパク質濃度を比較的簡便にかつ正確に測定する方法としてどのような方法が考えられますか？ よろしくお願いいたします。

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