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(無題) 削除/引用 No.9358-9 - 2020/12/08 (火) 03:44:08 - concon たろー様 大変ご丁寧にご回答くださり、心から感謝しております。 きちんと共焦点の原理から勉強します。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9358-8 - 2020/12/07 (月) 07:38:04 - たろー なるほど、ピンホールが5AUになっていたならおそらくそれが原因でしょう。 これで直れば他の要素はまあ大丈夫なのだと思います。 同じ1AUでも励起波長ごとにサイズは違うので、とりあえず1AU前後にして設定しておけば大きさはおっしゃる通り機械が勝手に計算してくれるのだと思います。ピンホールサイズを大きくすると画像がぼやける理由については、共焦点の原理を調べると出てくると思うので、一度確認しておくとよいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.9358-7 - 2020/12/07 (月) 06:27:38 - concon たろー様 ピンホールについてご説明していただき、重ねてお礼申し上げます。 今pinholeの設定を調べたところ、綺麗な画像を取得できていた時には1.1AUとなっていました。 ぼやけた画像の際には確か一番右に売り切れており、AUの値が5近くあったと記憶しています。 30 umとAUの下に書かれてあり、30 umとも書かれてありましたが、これがピンホールサイズってことなのですね。このサイズが大きければ大きいほどぼやけてしまうということですね。 また、AUの下に、AU calculated for 561と書かれてありましたが、これは561レーザーで励起した際のAUってことを意味しており、他にDAPIやAF488を使う際にはこの部分を切り替えて、各蛍光でもAUを1.1に設定するべきなのだと推察します。 一度設定をしっかり見直して再度扱ってみたいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9358-6 - 2020/12/07 (月) 03:19:33 - たろー >>AU すみません、略語で書いてしましましたが、airy unitの略です。airy unitググればでてくるかと思います。顕微鏡ではピンホールサイズはum表示になっているかもしれません。 AUは励起波長、レンズの、NAおよび倍率で規定されますが、そこにさらに各メーカーの装置倍率がかかってくるので、ここで正確な値は書けません。 メーカーもしくは顕微鏡の管理者は値を知っていると思います。共用顕微鏡なら、おそらくマニュアルなどどこかに、デフォルトのピンホールサイズとして1AUの値が記載されているかと推測します。 >>液浸については、同じ油を使っていても、レンズと液浸の間に水滴がついてしまったりすると散乱が大きくなり画像がぼやけてしまうことがあります。 絞りについては、こちらは現地の管理者の方に聞くしかないと思います。最近の共焦点は絞りがいじりにくいところについているので、前の使用者が変にいじくりまわしておかしくなったということはなさそうな気もします。 totoさんのおっしゃる通り一度条件が決まったらテンプレートとして残しておいてそちらを毎回読み込んで使うのがベストだと思います。

(無題) 削除/引用 No.9358-5 - 2020/12/07 (月) 00:58:24 - concon たろー様 語句に関して説明してくださり、ありがとうございました。 また、offsetは原則ゼロという書き込みを見てとても安心しました。 プロフェッショナルの方がそう言われるのであれば今後もゼロに設定していこうと思います。 ぼやけて見える場合の原因について羅列してくださり、ありがとうございます。 はい、シャープネスに関してきちんと理解していませんでした。すみません。 なるほど、確かにpinholeというものが右端にあったり、大体は左橋から少し右にあったり、に気づいてはいましたが、それが原因になりえるかは知りませんでした。 まずpinholeはなんなのか、1 AUというメモリはなかったと思うのですが、一度確認してみます。 油は同じものを使用していまして、絞りに関しては無知でわかりません。。 toto様 詳しいご説明、ありがとうございます。 Offsetの件、とてもよくわかりました。ありがとうございます。 Reuse機能があるとは知りませんでした。前回のパラメータを携帯のカメラで残しておけばよかった・・と後悔していたところなので、早速reuse機能で綺麗が画像が撮れるかトライしてみます。 とても親切で詳しい方からのコメントをいただけてとても感謝しています。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9358-4 - 2020/12/06 (日) 16:26:19 - toto たろーさんの書かれたとおりですが、ちょっと補足するとNIE elementsの場合、気にされてるように、オフセットは０でとるのが原則です。バックが高いときにそれを切るために−30などにする人がいますが、そうするとある輝度以下の情報が０になるので、journalによっては投稿したときに、バックグランドが検出されない（＝０になってる）のでだめといわれてしまうことがあります。それで各ピクセルのintensityが０＜で＜maxになるようにオフセットとHVを設定するのが撮影の基本です。シグナルが切れてるかは取得した画像のLUTをぐっと下げたときにノイズが出るかをみるとわかります。 また、そのセットではHVは大体１２０を超えないようにした方がs/n的にいいよいはずです。 画像が何かぼけるようにみえる、というのは時々起きますが、それが機器の設定のためでないことを確認するためには、前回の画像ファイルを右クリックしてreuse機能を使って、そのときの測定パラメータを再利用して撮影することで、区別がつきます。ＨＶもoffsetもpinholeも前回と同じ値にできます。サンプルが原因の場合は、たとえば周囲に強い蛍光を持つ領域があり、散乱が起きてる、あるいは、弱い蛍光を持つなにかの成分がサンプル全体に広がってたりすることで起きることが多いようです。

(無題) 削除/引用 No.9358-3 - 2020/12/06 (日) 15:02:42 - たろー >>>HV ひとつ書き忘れましたが、HVは一度条件検討をして至適な値を決めたら、基本的には理由がない限り変えないことをお勧めします。共用機器であれば常に値をチェックすることが重要です。 値が変わっていると過去の画像との比較は全くできなくなります。酷い場合だと、同じFig内で比較するための画像を違うHVで撮っていたりする例も見たことがあり、そんなことになればすべてのデータが取り直しになります。

(無題) 削除/引用 No.9358-2 - 2020/12/06 (日) 14:12:03 - たろー >>>HV PMT(光電子増倍管)にかける電圧を増やしています。値が大きいほどシグナルが増加しますが、同時にS/Nも悪くなります。ニコンのPMTはわかりませんが、浜ホトのPMTを使っているならば浜ホトのHPに電圧とS/Nの関係のグラフが出ていると思います。700V前後から急激にS/Nが悪化する印象があります。 >>>オフセット 顕微鏡のシグナルから値を差し引いています。多少のオフセットをかけるバックグラウンドが消え綺麗な画像になりますが、文字通り生の画像から値を引き算しているので重要なシグナルが消えたり、逆に見たくない画像を消してしまうといったようなことが起こりえます。基本的には0でいいかと思います。バックグラウンドは後の画像処理で差し引くのが通常かと思います。 >>>シャープ? いわゆるシャープネスという専門用語を正しく使用していない印象を受けます。コンフォーカルの画像がぼやけて見える場合は、ピンホールのサイズが1AU前後になっているかまずは確認してみてください。その他にも、レンズの液浸、補正環、絞りなど考えることはいくつかありますが、そのあたりは現物を見ないと難しいのでラボの詳しい方に聞くのがよいかと思います。

共焦点顕微鏡でのHVやoffsetについて 削除/引用 No.9358-1 - 2020/12/06 (日) 13:46:50 - concon いつも拝見させてもらっています。 私はつい最近、コンフォーカルを使うようになりました。 顕微鏡はニコンのC2です。 ソフトはNIS-elementsなのですが、画像取得の際のパラメータの設定に関して質問させてください。 機器は共通機器のため様々な方が利用されています。 ただ私が画像取得すると毎回蛍光の感じが異なり、原因究明したところ、HVとoffsetというパラメータが前回と異なっているとわかりました。それが原因かはまだわかりません。 HVとoffsetというパラメータが各蛍光物質に対してあり、Nikonのマニュアルを見るとoffsetは基本0で使用すると書かれてありました。なので私はゼロで指定していますが、他の方は-30や-5などoffsetをいじっているようです。 HVやoffsetについてこうしたらいいよ、というコンセンサスやアドバイスがありましたら教えていただけませんか？Offsetをいじることは何を期待しているのでしょうか？マニュアルにはその辺載っておりませんでした。 あと、前回はすごくシャープが画像が撮れたのですが、今回はなんだかぼやけている画像しか撮れませんでした。コンフォーカルなのにぼやけ？と本末転倒な気もします...おそらくセッティングが前回と異なっているのだと思いますが、今のところ同定できていません。 以上、2つの質問につき、アドバイスやコメントをいただけるようでしたらとても嬉しく思います。 どうぞ、よろしくお願いいたします。

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