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Anti-DDK (FLAG)抗体のレビュー トピック削除
No.9399-TOPIC - 2020/12/29 (火) 22:56:54 - kent
現在Flag tagを付けてあるタンパク質をマウスに発現させていますが、SIGMAのM2抗体でもwestern blotでかろうじて見えるぐらいです。もっとはっきりと検出するためにIPを考えていますが、これとは別にOriGeneにあるAnti-DDK抗体というものを見つけました。M2との比較でより感度が良さそうなのですが、実際に試されている方がいましたらぜひ感想をお聞かせください。
よろしくおねがいいたします。
Clone OTI4C5, Anti-DDK (FLAG) monoclonal antibody
 
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(無題) 削除/引用
No.9399-16 - 2021/01/02 (土) 08:57:12 - TOK
> 昨日L5を購入しましたので、まずはそれを試してみます。
L5はrat IgGですので二次抗体にお気を付けください。念のため。

(無題) 削除/引用
No.9399-15 - 2021/01/01 (金) 01:09:24 - kent
TOKさん、

さらなる情報ありがとうございます。
今までM2とのほかにFG4Rというのも使っていましたが、いまいちでした。
またGenescriptからの抗体もダメでした。
rabbitのpolyclonalは検出はいいのですが、バックが高くて困っていました。
昨日L5を購入しましたので、まずはそれを試してみます。
ご助言ありがとうございます。

>[Re:13] TOKさんは書きました :
> > L5の情報、ありがとうございます。試されたことはありますか?
> いくつかのタグ付きタンパクに対し手持ちのクローンを個々に適当に試した結果、L5の心証がよかったという感じでちゃんとした比較データはないです。
> 代わりに先の引用とは別会社からのL5データで貼っときます。
> www.novusbio.com/products/dykddddk-epitope-tag-antibody-l5_nbp1-06712
>
> あと、Clone FLA-1もよかった記憶が。M2はFLAG開発したSigmaのものだけど、後発抗体もいろいろいいのあるということだね。

(無題) 削除/引用
No.9399-14 - 2021/01/01 (金) 01:07:07 - kent
おおさん、

抗体で対処できるならそれが早くて簡単かなと思っていますが、抗体でそれほど改良できないようでしたらぜひ試してみます。
ありがとうございます。

>[Re:11] おおさんは書きました :
> >[Re:6]  vbんjkmさんは書きました :
>
> > 分画はkitもあるけど、界面活性剤フリー低張buffer→遠心→沈殿を0.5%TritonX100 bufferに溶かす、→遠心→沈殿をSDS-sammple bufferの3段階でもかなりいい感じに濃縮できる。
>
> 一度やる価値があるとおもいます。ただ組織であまりLysateを作るとき見ないのでちょっと躊躇していました。
> たとえば等張でもしっかりホモジナイズするとミトコンドリアが単離できますし、細胞質にある可溶性蛋白であれば、弱いデタージェントでしっかりホモジナイズすれば溶出してきて、あまり繊維状の成分などを可溶化しない状況で細胞内の蛋白が溶出できるのではないかと思ってます。組織なそれなりのホモジナイズ(物理的分散)が必要なので、そこだけ注意したほうがいいでしょう。
>

(無題) 削除/引用
No.9399-13 - 2020/12/31 (木) 20:28:21 - TOK
> L5の情報、ありがとうございます。試されたことはありますか?
いくつかのタグ付きタンパクに対し手持ちのクローンを個々に適当に試した結果、L5の心証がよかったという感じでちゃんとした比較データはないです。
代わりに先の引用とは別会社からのL5データで貼っときます。
www.novusbio.com/products/dykddddk-epitope-tag-antibody-l5_nbp1-06712

あと、Clone FLA-1もよかった記憶が。M2はFLAG開発したSigmaのものだけど、後発抗体もいろいろいいのあるということだね。

(無題) 削除/引用
No.9399-12 - 2020/12/31 (木) 20:15:49 - TOK
> これほどM2との違いがあればもっと広まっている気がするのですが、今まで聞いたことがなかったので、興味があります。
独占販売かどうかはわかりませんが、ライセンスに出したところが大手ではないですね(失礼)。あと、リンク先を読むと、N末側にFLAGを付けた場合しか認識しないこと、3xFLAGはダメなことなど癖があり、常にM2越えするのかちょっと不安も。でも、私も試してみようかなとも思う。

(無題) 削除/引用
No.9399-11 - 2020/12/31 (木) 07:53:16 - おお
>[Re:6]  vbんjkmさんは書きました :

> 分画はkitもあるけど、界面活性剤フリー低張buffer→遠心→沈殿を0.5%TritonX100 bufferに溶かす、→遠心→沈殿をSDS-sammple bufferの3段階でもかなりいい感じに濃縮できる。

一度やる価値があるとおもいます。ただ組織であまりLysateを作るとき見ないのでちょっと躊躇していました。
たとえば等張でもしっかりホモジナイズするとミトコンドリアが単離できますし、細胞質にある可溶性蛋白であれば、弱いデタージェントでしっかりホモジナイズすれば溶出してきて、あまり繊維状の成分などを可溶化しない状況で細胞内の蛋白が溶出できるのではないかと思ってます。組織なそれなりのホモジナイズ(物理的分散)が必要なので、そこだけ注意したほうがいいでしょう。

(無題) 削除/引用
No.9399-10 - 2020/12/30 (水) 22:05:20 - kent
COIさん

情報ありがとうございます。
お使いになられたことはありますか?
これほどM2との違いがあればもっと広まっている気がするのですが、今まで聞いたことがなかったので、興味があります。

>[Re:7] COIさんは書きました :
> https://www.transgenic.co.jp/products/antibodies-product/transgenic/detail/KO602-S.html
>
> http://plaza.umin.ac.jp/j_bio/2h8.html

(無題) 削除/引用
No.9399-9 - 2020/12/30 (水) 22:03:41 - kent
vbんjkmさん

部位で大きな差はないと想定していますが、現在同時にIHCも行っています。
分画も確かに有用化と思います。
ありがとうございます。

>[Re:6]  vbんjkmさんは書きました :
>
>
>
> 脳全体で発現してるの?部域で差異はないの?あればそこだけ取ってくるとか。
> 分画はkitもあるけど、界面活性剤フリー低張buffer→遠心→沈殿を0.5%TritonX100 bufferに溶かす、→遠心→沈殿をSDS-sammple bufferの3段階でもかなりいい感じに濃縮できる。

(無題) 削除/引用
No.9399-8 - 2020/12/30 (水) 22:01:58 - kent
TOKさん

L5の情報、ありがとうございます。
試されたことはありますか?
あればぜひ感想をお聞かせください。

4C5とM2との比較がOrigeneのサイトにありましたが、発売元が示しているデータですので、実際に試された方のレビューを聞きたいと思っていました。

origene.com/products/antibodies/tag-antibodies

>[Re:5] TOKさんは書きました :
> Origeneのクローンは知りませんでした。このクローンがよさげというはどのような理由からですか?

(無題) 削除/引用
No.9399-7 - 2020/12/30 (水) 21:37:38 - COI
https://www.transgenic.co.jp/products/antibodies-product/transgenic/detail/KO602-S.html

http://plaza.umin.ac.jp/j_bio/2h8.html

(無題) 削除/引用
No.9399-6 - 2020/12/30 (水) 20:49:21 -  vbんjkm



脳全体で発現してるの?部域で差異はないの?あればそこだけ取ってくるとか。
分画はkitもあるけど、界面活性剤フリー低張buffer→遠心→沈殿を0.5%TritonX100 bufferに溶かす、→遠心→沈殿をSDS-sammple bufferの3段階でもかなりいい感じに濃縮できる。

(無題) 削除/引用
No.9399-5 - 2020/12/30 (水) 13:41:54 - TOK
Origeneのクローンは知りませんでした。このクローンがよさげというはどのような理由からですか?

(無題) 削除/引用
No.9399-4 - 2020/12/30 (水) 13:37:10 - TOK
サイドバイサイドで比較したわけではないのですが、私はクローンL5にたどり着きました。
販売会社のTDSからそのまま抜き出すと、

The L5 clone has been demonstrated to have 2-8 fold better sensitivity in WB than another commonly used antibody clone, M2.

だそうです。

(無題) 削除/引用
No.9399-3 - 2020/12/30 (水) 02:43:48 - kent
おおさん、

組織は脳で、RIPAを加えてsonication後、遠心で上清を使っています。
培養細胞で発現させた際の発現確認に同様な方法を使っていました。
培養細胞に比べて細胞の割合が少ないなどで発現が難しくなることは想定していましたが、あと少し感度を上げて検出したいと思っています。

>[Re:2] おおさんは書きました :
> 抽出方法などの工夫で感度があがることはあると思いますが、そういう方法論的なものはどのように対応していますか?

(無題) 削除/引用
No.9399-2 - 2020/12/30 (水) 02:23:57 - おお
抽出方法などの工夫で感度があがることはあると思いますが、そういう方法論的なものはどのように対応していますか?

Anti-DDK (FLAG)抗体のレビュー 削除/引用
No.9399-1 - 2020/12/29 (火) 22:56:54 - kent
現在Flag tagを付けてあるタンパク質をマウスに発現させていますが、SIGMAのM2抗体でもwestern blotでかろうじて見えるぐらいです。もっとはっきりと検出するためにIPを考えていますが、これとは別にOriGeneにあるAnti-DDK抗体というものを見つけました。M2との比較でより感度が良さそうなのですが、実際に試されている方がいましたらぜひ感想をお聞かせください。
よろしくおねがいいたします。
Clone OTI4C5, Anti-DDK (FLAG) monoclonal antibody

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