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(無題) 削除/引用 No.9421-12 - 2021/01/11 (月) 23:35:49 - もう 【パスワードを忘れたのでこれにて解決とさせていただきます】 >>例えばIntactな細胞と比較するといいかもしれません。細胞表面などへの非特異な吸着はネガコン（バックグランドれべる）としてつかえるでしょう。 非特異吸着がありえるという意味ではたしかに細胞をネガコンにするのが良さそうですね >>そういう細胞成分にはかなりの量のタンパク質があると思いますが、、、だからいろいろなオルガネラや細胞質などの蛋白を検出すればいいんじゃないでしょうか。 そうなんです。それがバッチリ検出できれば良いのですがやはり核酸染色で見るのがシンプルで良さそうですね みなさまありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.9421-11 - 2021/01/11 (月) 11:58:54 - 独り言 エキソソームの回収方法とか調べれば、膜構造体とタンパク質を分離する方法わかるかも

(無題) 削除/引用 No.9421-10 - 2021/01/10 (日) 18:09:01 - おお >[Re:6] もうさんは書きました : > おおさん > タンパク凝集体にもPIが非特異的に結合して薄く染まるなどの可能性を回避するためにネガコンをおければいいのですが思いつきません。 例えばIntactな細胞と比較するといいかもしれません。細胞表面などへの非特異な吸着はネガコン（バックグランドれべる）としてつかえるでしょう。 ＞主成分は膜やオルガネラなどの核酸以外が主成分 そういう細胞成分にはかなりの量のタンパク質があると思いますが、、、だからいろいろなオルガネラや細胞質などの蛋白を検出すればいいんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.9421-9 - 2021/01/10 (日) 16:58:26 - もう お二人ともありがとうございます 仮に分離できてもそれぞれがタンパクなのか細胞片なのかというのは分からないままですよね、、、 一応粒度分布でも見ているのですが数umの単一のピークがあるのみで、これも大きなタンパク凝集体といわれればそれまでな気がしています やはりタンパクではないという意見が多そうですね 仮にヘテロなものであっても核酸があるとあたりをつけて染色するのが良いのですかね ほかのご意見もお待ちしてます

(無題) 削除/引用 No.9421-8 - 2021/01/10 (日) 16:32:18 - クァw瀬drftgy不二子lp 細胞の中で自然に生じたタンパク質の凝集体が目視で観察できるくらいのサイズだとしたら例外的に巨大な凝集体だと思いますが、ちょっと考えにくいです。凝集体同士がさらに集合してスーパーコンプレクスを形成したとしても、それなりの量の小さい凝集体がいるので、たぶんそれもないかなと。で普通にかんがるとたぶんデブリスだろうと思います. 細胞が調子が悪かったり、培養条件が合わなかったり、コンフレントのまま長く放置してたりすると増えます。細胞の残骸ですので核だけとか特定の細胞成分だけみたいに綺麗に分かれて浮いてるわけではありません。例えば核の一部に細胞骨格がくっついてそれに細胞膜の一部もくっついてDNAも少し混じってたりみたいな感じで極めてヘテロなものです。いろんなものがいろんな割合で混じった混合物ですので、それ自体を分画して調べる対象として適切なものかどうかはわかりません。 ただ１つだけ留意したほうがいいのは、クロマチン などの核成分やミトコンドリアが細胞死に際して能動的に細胞外へ放出される現象は一部の細胞で観察される場合があります。細胞が調子悪くてというのとは別で、これ自体は生物学的にも色々な意味があります。目で見えるかどうかはわかりませんが、IIFでは観察できます。

(無題) 削除/引用 No.9421-7 - 2021/01/10 (日) 15:33:19 - 独り言 スクロースグラジェントである程度の大きさとみてみては。 相当大きなタンパク質凝集体でないかぎり、膜断片とは分離できると思います。

(無題) 削除/引用 No.9421-6 - 2021/01/10 (日) 13:06:35 - もう おおさん ありがとうございます >>Apoptotic bodyの可能性が高いと思います。凝集体の判断基準をどのように置くかわかりませんが、回収して蛋白だけじゃなく、DNAやRNAがあるかどうか、ミトコンドリア、核、細胞質の蛋白が混在するか、脂質があるかなど検出していくのも手かもしれません。 ここで2つ気になることがあります。 一つはPIのような核染色試薬で染まって見えた場合、それは本当にタンパクではないと言えるのでしょうか？ タンパク凝集体にもPIが非特異的に結合して薄く染まるなどの可能性を回避するためにネガコンをおければいいのですが思いつきません。 興味の範囲でなら深追いしなくても良いのですが、今後のヒントのためにも知っておきたいです もう一つは核酸染色がされなかった場合に、答えはタンパクだとは言えませんよね？今回の凝集物の主成分は膜やオルガネラなどの核酸以外が主成分という可能性は出てこないでしょうか？ それとも細胞死で出てくる細胞片といえば核が含まれるのが常識なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9421-5 - 2021/01/10 (日) 08:22:00 - おお ちなみにアポトーシスでは核condensationがおこりApoptotic bodyに取り込まれるのである意味凝集ですが、生理的プロセスでできたものでもあります。

(無題) 削除/引用 No.9421-4 - 2021/01/10 (日) 03:47:10 - おお Apoptotic bodyの可能性が高いと思います。凝集体の判断基準をどのように置くかわかりませんが、回収して蛋白だけじゃなく、DNAやRNAがあるかどうか、ミトコンドリア、核、細胞質の蛋白が混在するか、脂質があるかなど検出していくのも手かもしれません。 あるいは細胞のCell deathの状況をリアルタイムで観察していくとどのようにその構造体ができたのか観察できるので、由来がある程度明確になるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.9421-3 - 2021/01/09 (土) 18:32:49 - もう sさん 目的はただの興味です。 どちらかだと分かれば次のアクションが...ということはありません 電顕は使ってみたい気持ちはあるのですが設備的に現実味がないのと、ただの興味で外注するわけにもいかず。。 “塩酸グアニジン処理でほぼ確実にタンパク凝集体は解離できるが、核や膜成分は溶解されない”のような知見があれば嬉しいのですが

(無題) 削除/引用 No.9421-2 - 2021/01/09 (土) 16:48:08 - s ちょっと目的がわかりかねますが、「細胞の破片」が生細胞における構造を判別可能な程度残しているのなら、電顕で見るのはどうでしょう。

細胞片とタンパクの区別 削除/引用 No.9421-1 - 2021/01/09 (土) 13:59:32 - もう 動物細胞を使って浮遊培養を行っています。 培養数日後、遠心したところ細胞以外のものがみとめられました。 1000rpmで何度遠心しても細胞と違い落ちてこないもので、生細胞染色試薬では染まりません これが細胞片（膜や核やオルガネラ等）なのか宿主由来タンパクの凝集体なのか知りたいと思っています 顕微鏡では明らかに15umの細胞より小さく数um トリパンブルーでは染まりますが生細胞のような膜に囲まれた構造でなければなんでも染まってしまいますよね？ 元素分析ではどちらにせよCやOばかりが出るでしょうし、細胞片でもタンパクを含むため尿素等で処理して電気泳動で何か見つかっても結論は付けられないと思います 1万rpmで回収できますが乾燥させると1mg程度ですので量を使う分析は見込めません 細胞は死に始めているのでシンプルに考えると細胞片かと思うのですがタンパク凝集体ではない説明ができません 実験自体は再現がとれています お力添え下さい

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