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(無題) 削除/引用 No.9431-16 - 2021/01/19 (火) 16:01:52 - zinc > IPがうまくいかない原因は主に２つです。 １）使用している抗体がIPに適さない。 ポジコンにはHistone H3抗体を入れています。qPCRでクリアなデータシートに出ていたので、とりあえず、購入したのですが、モノクロだったんですよね。おそらく、validateはされているはずなので、これが原因とは今のところは考えておりませんが、類似商品のポリクロにしておくべきでした。 > 2)抗原分子が十分可溶化できていないことがあります。 転写因子やヒストンがターゲットです。 いずれにせよ、inputとIP後のDNAサンプルがqPCRをしても全く同じ存在量になるということは、抗体の沈降自体がうまくいっていないのではと思っています。 Protein AやGと抗体、および抗体とターゲットは、オーバーナイトの間に、平衡に達して、簡単にcomplexを形成するものと思っていましたが、思わぬ苦戦です。

(無題) 削除/引用 No.9431-15 - 2021/01/19 (火) 10:31:41 - えrちゅい ビーズはIP自体（目指す分子をしっかり捕まえてくること）がができるかどうかという点についてならば成否には本質的な影響はないです。（non specificなタンパク質の持ち込み具合には材質やメーカーによりかなり大きな差異がありますが。）ですのでIP自体ができていないならば以下のことをまず検討ください。 IPがうまくいかない原因は主に２つです。１）使用している抗体がIPに適さない。天然状態において抗体が認識部位に接近できないなどが原因で、モノクローナル抗体や合成ペプチドを抗原として作ったモノスペシフィックのポリクローナル抗体でしばしば起こることがあります。→その抗体を使用する限り解決は困難なのでIP可能検証済みの抗体に変えてください。もし適当なものがなければ、なるべくなら全長を抗原として免疫して得たポリクローナル抗体を使うことも一つです。最近の市販抗体の多くは抗原ペプチドで免疫してるものが多く、IPへの適用可能なものは必ずしも多くないです。 2)抗原分子が十分可溶化できていないことがあります。難溶性タンパク質などで、使用している可溶化bufferで可溶化できず、もともとIP用の検体中に抗原分子がほとんどないとか。→現在使用している可溶化bufferで抗原分子が十分可溶化できていることをチェックし必要ならば可溶化bufferの種類や条件を検討するなどします。通常のマイルドなbufferでは溶けないような例えば真在性膜タンパク質のような場合は、最後の手段としてSDS可溶化・加熱→TX100で再生→IPという方法もあるけど、経験では成功率はあまり高くないです。 1,2がクリアできていれば、正直な話、かなり適当なことやっててもIP自体はできます。

(無題) 削除/引用 No.9431-14 - 2021/01/16 (土) 03:44:23 - zinc 細かいことは、ここでは言えないのですが、免疫沈降を利用した特殊なプロトコルでして、抗体の回収は確認しないのが通常のプロトコルになっています。 とは言え、免疫沈降までは通常のプロトコルと同じはずです。 結果が悪いとなると、一度抗体の確認が必要そうですね、、、、 ビーズの混ぜ方、順序はやはり気にした方がいいですかね？ 念には念を入れて。

(無題) 削除/引用 No.9431-13 - 2021/01/16 (土) 02:54:03 - おお >[Re:12] zincさんは書きました : > > 離したProtein AやGがもしかしたらあるのかもしれない（勝手な想像ですけど）。 > > これは目からウロコです。もちろんアジ化ナトリウムとＰＢＳのみなので、何故みんな何度も洗浄しているのだと思っていました。実は人からもらったプロトコルなので、盲目的にビーズを加えていたのですが、やはり洗浄が必要な気がします。 > あとは生産プロセスがよくわからないので、ビーズにProtein A、Gを結合した試薬や副産物の残渣など含まれている場合もあるかと。 で以下のことはどうなんですか？ ところで、目的の蛋白が回収できないと言っているが、抗体は回収できているのか？ 確認だけど目的の蛋白の抗体を使っているのですよね？目的の蛋白に結合する蛋白の抗体をつかっているのではないですよね。

(無題) 削除/引用 No.9431-12 - 2021/01/15 (金) 20:02:01 - zinc 細かいことは追加しませんが、免疫沈降で絶対に上手くいくポジコンの抗体も解析していますが、これも上手くいっていません。 混ぜ方はあまり重要ではないのですか？人によってだいぶやり方が違う気がします。人によっては、前日からビーズ抗体コンプレックスを仕込んだ上に、lysateは、同じくビーズでpreclearする念の入れようです。 離したProtein AやGがもしかしたらあるのかもしれない（勝手な想像ですけど）。 これは目からウロコです。もちろんアジ化ナトリウムとＰＢＳのみなので、何故みんな何度も洗浄しているのだと思っていました。実は人からもらったプロトコルなので、盲目的にビーズを加えていたのですが、やはり洗浄が必要な気がします。 https://www.google.com/amp/s/www.whatisepigenetics.com/a-starter-chromatin-immunoprecipitation-chip-protocol/amp/ これはchipなので私の目的とはちがいますが、 It is also important to wash the beads once with dilution buffer before adding them to your lysate; the storage buffer contains chemicals that can cause problems later in the procedure. と記載されていますね。

(無題) 削除/引用 No.9431-11 - 2021/01/15 (金) 17:07:32 - おお 使っている抗体がIgMというオチはないですよね。。。

(無題) 削除/引用 No.9431-10 - 2021/01/15 (金) 17:04:50 - おお まず、ビーズと抗体を混ぜるのが正しいとか、抗体が先とか、同時とか言うところでどれが正式とかいう考えはあまり良くないと思います。免疫沈降の初期の方法論は抗体を抗原がある溶液にまぜて、抗体が抗原と凝縮することで沈降させるというのが由来です。それにビーズを加えて抗体を補足することで、凝縮が出来にくいものも沈降ができます。 しかしながら、予め抗体をビーズにこばれんとに固定したものも売っています。それを使うと抗体にを先にLysatesなどの加えることができません。 要するにどちらでもワークする可能性があるということです。裏を返せばよりうまくいく方法を模索することも考えるべきだということです。 くわえてDynabeadsについてくる添付文書ちゃんと見てくださいDynabeadsは０．０１％のTween２０と０．０９％のアザイドの入ったPBSに懸濁されています。そのままLysatesに入れても抗体の能力に影響したり、蛋白（ほとんどの）に影響するようなものは入っていません。ただしWash、Lysateと同じバッファーに置換したほうがベターではあると思います。遊離したProtein AやGがもしかしたらあるのかもしれない（勝手な想像ですけど）。 ＞また、下記の論文のQ and Aを見ると、cell lysateをあらかじめbeadsに通さないと、ビーズにタンパク質が非特異的に結合するようです。そうなると抗体が付く余地がなくなりますよね。 非特異な結合はProtein AやGというよりはビーズに直接つくという懸念のほうが大きいです。たとえ非特異にProtein AやGへ結合があったとしても、そこにもっと相互作用の強い特異的なものが接触したらどうなるか考えてみてほしい。もちろん１００％とはいえないけど。 なので今回目的の蛋白が沈降しないのがこの原因ではないだろうともいえる。 ところで、目的の蛋白が回収できないと言っているが、抗体は回収できているのか？ 確認だけど目的の蛋白の抗体を使っているのですよね？目的の蛋白に結合する蛋白の抗体をつかっているのではないですよね。

(無題) 削除/引用 No.9431-9 - 2021/01/15 (金) 16:59:47 - そも ビーズと抗体を先に結合させるのは遊離の抗体をライセートに持ち込ませないために重要です。 いっぺんに混ぜた時は遊離抗体に目的タンパクが取られてしまって回収量が減っているのだと思います。 ビーズの洗浄しかり一般的なプロトコルを確認することをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.9431-8 - 2021/01/15 (金) 16:58:04 - G25 Dynabeadsなら最初から書けばいいのに。 あなたが最初に「thermofisherのmagnetic beads　Ａ／Ｇ」なんて書くから別の製品のマニュアルを参照してしまったわけだが。 どっちにしろ、混ぜる順番はいろいろあるんだから、あなたの失敗の原因ではない、ということが言いたかったのです。 >また、下記の論文のQ and Aを見ると、cell lysateをあらかじめbeadsに通さないと、ビーズにタンパク質が非特異的に結合するようです。そうなると抗体が付く余地がなくなりますよね。 どのFAQのことを指しているのかわからないけれど、 なにか間違った解釈をしていると思うよ。pre-clearに関することじゃないかな？レジンそのものへの非特異的吸着のことであって、Protein A/Gに非特異的に吸着してIgの結合をブロックするって話じゃないんじゃない？ 他の方の回答にもあるように、IPはどんな抗体でも、どんな条件でも、うまくいって当たり前ってものではないので、そういう小手先の手技上の問題ではない可能性を念頭に置いたほうがいい。

(無題) 削除/引用 No.9431-7 - 2021/01/15 (金) 14:34:18 - zinc >[Re:6] G25さんは書きました : > >beadsと抗体を混ぜて、beads-抗体 complexを作成して、それからprotein lysateを入れないとダメなんでしょうかね。 > > それもマニュアル通りではないし、IP-Westernなどでは一般的でない。 > しかし、予め抗体を結合させたレジンのカラムでプレパラティブな抗原捕捉をする手法もあるから、混ぜる順番でワークしなくなるということはないだろう。 正式なマニュアルを見ると、ビーズと抗体を先に結合させているんですよね。 https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0015809_Dynabeads_Protein_G.pdf また、下記の論文のQ and Aを見ると、cell lysateをあらかじめbeadsに通さないと、ビーズにタンパク質が非特異的に結合するようです。そうなると抗体が付く余地がなくなりますよね。 https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-assays-analysis/immunoprecipitation/immunoprecipitation-faqs-dynabeads-magnetic-beads.html

(無題) 削除/引用 No.9431-6 - 2021/01/15 (金) 14:18:47 - G25 >beadsと抗体を混ぜて、beads-抗体 complexを作成して、それからprotein lysateを入れないとダメなんでしょうかね。 それもマニュアル通りではないし、IP-Westernなどでは一般的でない。 しかし、予め抗体を結合させたレジンのカラムでプレパラティブな抗原捕捉をする手法もあるから、混ぜる順番でワークしなくなるということはないだろう。

(無題) 削除/引用 No.9431-5 - 2021/01/15 (金) 13:43:33 - FCM まずはその抗体が免疫沈降に使えるかどうかは確認済みでしょうか？ 抗体には向き不向きがありますので、一度確認をお願いします。 また、免疫沈降後にタンパク質電気泳動を行われたと思いますが、その時のゲルやPVDF膜のタンパク質をCBB液やポンソー液で染めてみると抗体がビーズに付いているかどうかがわかります。

(無題) 削除/引用 No.9431-4 - 2021/01/15 (金) 13:27:46 - zinc 表記に誤解がありました。AとGは別々のDynabeadsという製品を買って混合しています。 プロトコールを見ていたら、混ぜる順番が重要なんですかね。最初に、beadsと抗体を混ぜて、beads-抗体 complexを作成して、それからprotein lysateを入れないとダメなんでしょうかね。 人から頂いたプロトコールでしたので、一緒くたに混ぜていました。。。 ここが本当に原因かわからないのですが、オーバーナイトインキュベーションする間にbeads-抗体-目的タンパク質のcomplexができると思っていましたが、実は、混ぜるとbead-抗体 interactionが形成されずらいんですかね。

(無題) 削除/引用 No.9431-3 - 2021/01/15 (金) 13:21:17 - G25 少なくともマニュアルどおりの使い方ではありませんね。 マニュアルでは使用前にWash buffer (TBS+ Tween20など）で洗浄しています。洗浄しなかった場合、どの程度、影響がるのかはわかりませんけれど。 https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0015742_2162339_88802_88803_Pierce_Protein_AG_MagBeads_UG.pdf

(無題) 削除/引用 No.9431-2 - 2021/01/15 (金) 12:33:47 - zinc タンパク質の沈降実験をしているのですが、なぜか目的のタンパク質が沈降しないため質問させていただいています。 ＡとＧのビーズをサーモから購入し、懸濁してある液体ごと、タンパク質のライセートと抗体を入れたチューブに加えたのですが、ビーズの液体が原因ではないかと疑っています。 沈降系の実験経験がないので質問させてもらいます

magnetic beadsの使い方 削除/引用 No.9431-1 - 2021/01/15 (金) 12:20:35 - zinc 抗体を吸着するために、thermofisherのmagnetic beads　Ａ／Ｇを使っています。 使用前にwashする必要があるのでしょうか？

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