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(無題) 削除/引用 No.9444-9 - 2021/01/22 (金) 05:07:24 - おお FITC-anti-CD45とbiotin-anti-CD45の競合ですが、確かにFITC-anti-CD45が過剰にあればbiotin-anti-CD45は外れてゆくと思います。問題は平衡に達するまでどれくらい時間がかかるか。１日、２日、それとも１週間、、、 どなたか計算できる人がいればとはおもいますが。

(無題) 削除/引用 No.9444-8 - 2021/01/22 (金) 04:41:09 - FCM 私もFITC-Streptavidinで染めるといいかなと思いますが、FITC-anti-CD45がbiotin-anti-CD45の競合的阻害剤になる、という考えには賛成（特にクローンが同じ場合）ですので、可能でしたら両方試してはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.9444-7 - 2021/01/21 (木) 23:50:54 - い これはまずは普通に蛍光標識ーストレプトアビジンで染めるのが筋と思う。

(無題) 削除/引用 No.9444-6 - 2021/01/21 (木) 18:55:04 - びおっち 皆様、コメントしていただいてありがとうございました。 ビオチン-ストレプトアビジンのdissociation constantを考えると、抗体-抗原反応の方が解離しやすいと考え、FITC-CD45抗体での置き換えが可能性があるとしたら無難かと思いました。また抗体抗原反応は付いたり離れたりを繰り返しているため、過剰の抗体を加えれば全てとは言えないですが大部分置き換わるだろうと考えておりましたが、ど素人様のCD44のご経験を聞くと、必ずしもそうではないのだと感じました。 CD45除去後に別の抗体とも染めたいので、二次抗体は使えないですが、それでも抗体の置き換えが無理そうなら、二次抗体のみで染めてみようと思います。 ミルティニーのデータもご紹介いただきありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.9444-5 - 2021/01/21 (木) 14:18:10 - ど素人 そういえば、ひとつ忘れていました。 以前とある抗マウスCD44抗体を、とある白血病細胞のブロッキングに用いました。 その後、ブロッキングされた細胞を洗浄して、蛍光標識の anti-CD44 抗体で標識してみたところ、蛍光標識が著しく阻害されたことがありました。これらは同一のクローンだった思います。これは NwN 様のいう解離しにくい場合だったようです。 ですので、先程の私の意見は楽観的すぎる面がありました。びおっち様の場合はうまくいく可能性もある(ミルテニーの例のような場合)ので試してみる価値はあるが、うまくいかない可能性もあるので、その場合は各ご助言のような、別の手段が必要だと思います。

(無題) 削除/引用 No.9444-4 - 2021/01/21 (木) 10:02:41 - ど素人 記憶では過去に、PBMCをCD8磁気ビーズでセレクションし、その後に抗CD8抗体で positive selection, depletion の両方の効率を評価していました。 ただし当時、磁気ビーズ抗体とフローサイトメトリー用抗体のクローン(エピトープ)を確認して行っていたわけではありませんけれども、わざわざ別のエピトープを標識しなくても、恐らくびおっち様がお考えのように、化学平衡でいくのではないかというのが個人的な意見です。 因みに、ミルテニーの磁気ビーズ製品のプロトコルでも同様の蛍光標識方法が記述されています。 https://www.miltenyibiotec.com/DE-en/shop/comMiltenyiDatasheet/product?productId=132

(無題) 削除/引用 No.9444-3 - 2021/01/21 (木) 10:02:20 - NwN dissociation constant を過小評価しています。 無理です。

(無題) 削除/引用 No.9444-2 - 2021/01/21 (木) 10:00:17 - おお Streptavidin-FITCで染めたら早いのでは？ biotin-CD45って書いているけどようはAnti-CD45 antibody biotinylated だよね？ その抗体に反応する２次抗体でもいいかもよ。 ビーズについたほうを見ようと思っているの？それともビーズにつかなかったほうを見ようとしているの？

biotin標識抗体の置き換え 削除/引用 No.9444-1 - 2021/01/21 (木) 07:53:51 - びおっち よろしくお願いします。 細胞をbiotin-CD45で染めたのち、PBSで洗浄後、ストレプトアビジンビーズでCD45で染まる細胞を除去しましたが、その除去効率を見たいため、磁場から取り出した細胞をFITC-CD45で染め直し、結合を見てみようと思いますが、この場合、細胞にすでに付いているビオチンCD45の量に比べ、FITC-CD45の量は大過剰量になるため、ほとんどのCD45抗体はFITC標識に置き換わるでしょうか？頭ではうまくいくはずだと思っていますがいかがでしょうか。

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