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プロテアーゼスクリーニング トピック削除
No.9502-TOPIC - 2021/02/13 (土) 04:22:19 - プロテアーゼ
自分が研究しているタンパク質が、一定の条件下では切断されることに気づきました。ある刺激を加えた細胞にリコンビナントのタンパクを加えてウェスタンをしたら、本来の位置より小さいサイズのバンドが検出されたのです。バンドを切り取って配列を読んで、切断が間違い無いことを確認しました。

次に、このタンパクを切断するプロテアーゼは何かを突き止めたいのですが、そのようなスクリーニングを行う良いキットなりサービスなりについてご存じの方おられませんか？

ネットで調べてはみたのですが、プロテアーゼのインヒビターのスクリーニングサービス（各種「基質とプロテーゼ」を会社側が準備していて、そこにこちらが持ち込んだサンプルを加え、どのプロテアーゼ反応が阻害されたかを網羅的に調べる）はいくつか見つかったのですが、私が求めている「基質（私が研究しているタンパク）を切断するプロテーゼはなにか？」を網羅的に調べるようなサービスはうまく見つけられませんでした。

ネット上にある切断予測プログラムはいくつか使ってみましたが、切断部位（正確な位置はまだわかってないですが）近傍に大量の候補が見つかってしまい、ターゲットを絞り切れずにいます。

どなたかご存知の方がおられましたら教えて頂けますか？よろしくお願い致します。
　
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No.9502-6 - 2021/02/13 (土) 18:56:00 - asasn

特定のプロテアーゼをいきなり探すのは大変なので、まずは分解のされ方、N末端から消えるのかC末端から消えるのか、とか、そのタンパク質を細胞系で発現させたりした場合なのかlysisサンプルに酵素活性のあるものがふくまれてるのか、状況が大雑把すぎるかと思います。
まずは、ドメインを削ったりしたGFPタグのタンパクとかを作る目的も含めて切断のされ方を明確にする方が先だと思いますが。

in vitroの系でやるならぶっちゃけ基質特異性のあるプロテアーゼなんて限られてるので、ある程度パネルを用意して活性系をくめるなら力技でできそうな気もするけど、そもそも見てる現象はlysatesレベルの話なの？細胞系なの？

lysateレベルの話だと結構可溶化条件などによってもプロテアーゼは混入して来るし、議論がかなり雑にはなりますねー。

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No.9502-5 - 2021/02/13 (土) 08:11:55 - ii
切断されている部位の配列、特にどのアミノ酸が切断末端になっているかがわかれば、各プロテアーゼの基質選択性からどのクラスのプロテアーゼっぽいか予想がつけられるかも。
もしくはFCMさんが言われているように、クラス選択的 (ただしクラス内では非選択的) な阻害剤でもって最初にアタリをつけて、以降siRNAとか選択性の高い方法で一個一個潰していくとか。

(無題) 削除/引用
No.9502-4 - 2021/02/13 (土) 05:42:54 - おお
クロマトなどでフラクショネーションしていって精製するのが正攻法だと思いますけど。

＞「基質（私が研究しているタンパク）を切断するプロテーゼはなにか？」を網羅的に調べるようなサービス

研究者の腕の見せ所ではないかと思うのだけど。単純作業的に試していくようなものではないし。

カルパインとか怪しいかなといういんしょうです。単なる感ですけど。

(無題) 削除/引用
No.9502-3 - 2021/02/13 (土) 05:27:33 - nak
クロスリンカーを用いてCo-IPしてみて、質量分析にかけてみるというのはいかがでしょうか？

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No.9502-2 - 2021/02/13 (土) 04:42:54 - FCM
基質が分かっているのならまずは各プロテアーゼ特異的なプロテアーゼ（セリンプロテアーゼ阻害剤、等）阻害剤を用いて、どの阻害剤で見ている基質の切断が阻害されるかを見てはいかがでしょうか。

プロテアーゼスクリーニング 削除/引用
No.9502-1 - 2021/02/13 (土) 04:22:19 - プロテアーゼ
自分が研究しているタンパク質が、一定の条件下では切断されることに気づきました。ある刺激を加えた細胞にリコンビナントのタンパクを加えてウェスタンをしたら、本来の位置より小さいサイズのバンドが検出されたのです。バンドを切り取って配列を読んで、切断が間違い無いことを確認しました。

次に、このタンパクを切断するプロテアーゼは何かを突き止めたいのですが、そのようなスクリーニングを行う良いキットなりサービスなりについてご存じの方おられませんか？

ネットで調べてはみたのですが、プロテアーゼのインヒビターのスクリーニングサービス（各種「基質とプロテーゼ」を会社側が準備していて、そこにこちらが持ち込んだサンプルを加え、どのプロテアーゼ反応が阻害されたかを網羅的に調べる）はいくつか見つかったのですが、私が求めている「基質（私が研究しているタンパク）を切断するプロテーゼはなにか？」を網羅的に調べるようなサービスはうまく見つけられませんでした。

ネット上にある切断予測プログラムはいくつか使ってみましたが、切断部位（正確な位置はまだわかってないですが）近傍に大量の候補が見つかってしまい、ターゲットを絞り切れずにいます。

どなたかご存知の方がおられましたら教えて頂けますか？よろしくお願い致します。
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