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(無題) 削除/引用 No.9514-12 - 2021/02/20 (土) 03:23:58 - PKK asanさん ご返信ありがとうございます。 Thermoの担当者にも確認はしておりまして、担当者いわく、 「バリデーションは、cDNAをテンプレートとすることを前提としており、試薬や機器は、Thermo製品を用いている」とのことでした。 cDNAでの解析も検証しているので、確かにその場合の増幅効率は102％と、ほぼ誤差範囲なので整合性はとれていると思います。 やはり、1stepの際の逆転写反応があやしいような気がします。 RNA濃度に依存して逆転写効率に差が出ているという線でもう少し調べてみます。

(無題) 削除/引用 No.9514-11 - 2021/02/19 (金) 11:19:12 - asan 理論上、目的のもの以外が増幅されてるか、非特異的な蛍光の増幅を見てる可能性が高いと思います。 Thermoの高いプライマーをかってるなら、サーモのテクニカルに100%こえるんだけどどうしたらいい？って聞いたほうが話は早いのではないかと思います。バリデーションされた、と言ってもどういう状況でバリデーションを取ったかによって想定外の影響は起こりうるし絶対的に常にワークするプライマーって本来はないです。

(無題) 削除/引用 No.9514-10 - 2021/02/19 (金) 02:04:02 - PKK ご返信ありがとうございます。 おおさん ＞効率が（誤差を考慮に入れて）１１０％を超えるようなら、PCRがちゃんとワークしてないと考えるべきです。 なるほど、やはり作業やプロトコル等になんらかの問題があると考えた方がいいのでしょうか。そうなると原因がやはりわからなくて悩んでおります。。 チューブへの付着の問題は、確かに効率が100％を下回りますよね。すっきりしました。ありがとうございます。 seventhさん ＞1stepだと濃度毎に逆転写の効率も異なってしまう可能性があるので ありがとうございます。その部分もう少し詳しく教えていただきたいのですが、RNA濃度が濃いほど、逆転写の効率が悪くなるのでしょうか？それとも良くなるのでしょうか？ ピペッティングについては、エアロゾルコンタミにだいぶ神経質になっているので、かなり慎重に行っています。各レプリケートのCt値を確認しましたが、バラツキはそこまで大きくないような気がしています。。 増幅効率の実測値については、3点と5点の2パターンで実施しており、どちらも110％を超えており、誤差のレベルではないと考えております。 (なみにですが、cDNAを使用した2stepの方は増幅効率102％で問題ありませんでした。) <GAPDH> 1step 3点　R2:0.999 Eff:113.1% 　　　5点　R2:0.988 Eff:138.2%

(無題) 削除/引用 No.9514-9 - 2021/02/18 (木) 12:04:00 - seventh 自分で希釈しているなら希釈がうまくいってないだけでは。仮にPCR効率100％でも手技やピペットマンの誤差で見かけ上の効率はずれます。 1stepだと濃度毎に逆転写の効率も異なってしまう可能性があるのでそのせいでPCR効率がずれて見える可能性が有ります。 実際のPCR効率や線形相関Rの数値が出てないので、本当におかしいのか誤差の範囲かは聞いてる側からは判別できないですが。

(無題) 削除/引用 No.9514-8 - 2021/02/18 (木) 06:15:52 - おお チップやチューブの付着が効率に与える影響は逆のような気がします。これも具体例を考えてみたらいいでしょう。 例えば１０コピー検出したときのCt値がCt(10)としましょう。３２０コピーのときのCt値はCt(10)ー５です。 １０コピーのとき仮にチューブにふちゃくしたなどのロスでPCRに実際にかかるコピーすうが５だとするとこのときのCt値はCt(10)＋１。３２０コピーではチューブなどの付着によるロスは無視できるとします。 理想的な状態で１０コピーは５サイクル３２０コピーにおいつく。 上記のチューブによるロスがあった場合１０コピーが３２０コピーにおいつく。には６サイクル必要。要するに効率が悪くなっています。

(無題) 削除/引用 No.9514-7 - 2021/02/18 (木) 05:04:32 - おお まずは効率が（誤差などの範囲以上で）１００％を超えることはありません。したがって効率が（誤差を考慮に入れて）１１０％を超えるようなら、PCRがちゃんとワークしてないと考えるべきです。 １ Stepと２ Stepでは酵素特性も違いますし、RTにスペシフィックを使うかの違いも大抵の場合はありますので、１ Stepでは今回の場合あまりうまくワークしていないと考えるのが妥当だと思います・ cDNAからのPCRがなにか悪さをしていると言いますが、１ Stepでもチューブ内でRTしてcDNAを作るわけですからそれが問題かどうかは慎重になるべきです。そもそも２ StepでcDNAを使うときに何らかの不都合があるという前提なら、効率が１００％になること自体がないわけで、それをむりやり１００％にするような条件はPCRとして成り立っていません。

(無題) 削除/引用 No.9514-6 - 2021/02/18 (木) 03:31:07 - PKK おおさんありがとうございます。 ＞つかったスタンダードに不純物が含まれているのでしょうか？ 使用したスタンダードRNAサンプルは、クロンテック社のPremium Total RNA（ヒト）です。 https://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100004824 「最高品質のRNA」とうたっているので、おそらく阻害物質はほとんど含まれていないかと思います。これをthermofisher社のバリデーション済のTaqMan Gene Expression Assaysのプライマー/プローブで1step qPCRしています。 (そのため、ノンスペやダイマーの可能性は低いのではないかと考えています) TaqMan Gene Expression Assaysのバリデーションについては、cDNAテンプレートを使用した2step qPCRでのバリデーションを実施しているそうです。cDNAテンプレートはRNAテンプレートより阻害効果がやや大きいことを前提としているため、RNAテンプレートの場合は結果的に100％を超えてしまうのではないか。とおおさんの回答から推察しましたが、どうでしょうか？ 以前こちらの掲示板から、「低コピーのスタンダードはチューブやピペットへの付着(残存)が原因で、増幅効率が100％を超えてしまう原因になる」と拝見したのですが、なぜそうなるのかいまいちわからず。。これが原因にもなりえるのでしょうか？ http://kenkyuu2.net/cgi-biotech2011/biotechforum.cgi?mode=view;Code=449

(無題) 削除/引用 No.9514-5 - 2021/02/17 (水) 17:04:58 - おお ちょっと待って下さい。スタンダードをつかって効率を測ったのですね。 つかったスタンダードに不純物が含まれているのでしょうか？そうでなければ他の要因を考える必要があります。たとえばプライマーがあまり良くなくノンスペやプライマーダイマーが生じるとか。

(無題) 削除/引用 No.9514-4 - 2021/02/17 (水) 14:14:53 - おお そういうことです阻害物質も希釈されると効果がよわくなるでしょうから。もちろん阻害物質が過剰で希釈されても阻害効果が変わらないこともあるかもしれません。効率が１００％を大きく超えるなら阻害物質を一つの可能性として疑ってみるという話です。 具体的に考えてみたらいいだけだと思いますが、 例えば４倍希釈のときのCt値をXとすると普通は原液のCt値はX-2 阻害物質があるとしたら原液のCt値はより大きくなります。極端な例を考えてX-1としましょう。この場合Ct値が１変わると４倍（４分の１）になっているわけだから増幅効率は２００％ではないですか？

(無題) 削除/引用 No.9514-3 - 2021/02/17 (水) 12:24:34 - PKK おおさん、ご返信ありがとうございます。 ＞サンプルを希釈するということは、阻害物質も希釈されるということですよね。 ということは、ある程度の阻害物質の存在を前提としている場合より阻害物質が希釈され少なくなり、結果的に増幅効率が大きくなるということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9514-2 - 2021/02/17 (水) 03:41:50 - おお >阻害物質の存在は、100％を上回る原因にもなりえるのでしょうか？ サンプルを希釈するということは、阻害物質も希釈されるということですよね。

qPCRの高すぎる増幅効率について 削除/引用 No.9514-1 - 2021/02/17 (水) 03:20:57 - PKK リアルタイムPCRのスタンダードの増幅効率について、100％を大きく超えた場合の原因をお分かりになる方いらっしゃいますでしょうか？ 100％を下回る原因は、PCR阻害物質の存在やプライマー/プローブの設計の問題などイメージが容易なのですが、上回る原因がいまいち理解できません。 阻害物質の存在は、100％を上回る原因にもなりえるのでしょうか？ なお、当方はtaqmanプローブ法を使用しており、プライマー/プローブは、thermofisher社のバリデーション済のTaqMan Gene Expression Assaysを使用しておりますので、プライマー/プローブについては問題ないかと考えております。 恐れいりますが、どうぞよろしくお願いいたします。

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