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(無題) 削除/引用 No.9544-9 - 2021/02/28 (日) 13:45:25 - 素人院生 おお先生　 お忙しいところありがとうございます。 勉強させていただきます。

(無題) 削除/引用 No.9544-8 - 2021/02/28 (日) 13:36:46 - おお あ、濃度は0.1-1 % と幅広い濃度のプロトコールが見られますが。１％もあれば大抵は十分です。それより多いプロトコールもあったような気もしますが。

(無題) 削除/引用 No.9544-7 - 2021/02/28 (日) 13:33:16 - おお PVP-40を使う場合がほとんどです。それより高分子のものでも使えます。ミルクはちょっと油断したらバクテリア生えてくるし、BSAは高いしということでこれにしています。 アクチンの抗体とかだと、PVPを含むブロッキングバッファーに希釈した状態で半年以上Reuseで使えたりもしますので、そういう意味でもありがたいです。PEGもPVPと併用したりするものもあるようです。

(無題) 削除/引用 No.9544-6 - 2021/02/28 (日) 13:18:36 - 素人院生 皆様 お忙しいところありがとうございました。 このpHがどのような状態で測定されたものなのか、見落としていました。 おお先生が仰る1%状態だとすると、cvghj先生が仰るように、必然的にpH7.0がブロッキング剤として使われてきたのかもしれません。 卵白アルブミンについても教えて頂きありがとうございます。 最後に、おお先生、もう一つお伺いしたいのですが、 PVPを使用するプロトコールを初めて知りました。 動物成分を含まないブロッキング剤として理想的なように思います。 様々な分子量のものが含まれてますが、PVP-40というものでよろしいでしょうか？ これも2%程度の濃度でTBS-Tween 20溶液に溶かして使用するのでしょうか。 お忙しいところ申し訳ありませんが、もし宜しければ教えてください。 最近、ナカライから5分でブロッキングができるという試薬が販売されているようで、ブロッキングも奥が深いのだな、と感じました。 https://www.nacalai.co.jp/products/entry/d005003.html 貴重なご意見ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.9544-5 - 2021/02/28 (日) 05:04:23 - おお >[Re:1] 素人院生さんは書きました : > お世話になります。 > > 些細なことなのですが、教えてください。 > > ウエスタンブロッティングのブロッキング剤としてBSAを使用しています。 > > 当研究室では、ナカライ： 01281-26 、 Albumin, Bovine Serum, Globulin Free , pH 6.5 - 8.0, 37,900円 を使用するように指導されました。 > > （もちろんミルクを使うこともあります） > > > BSAはコーンの分画法というもので作られていると、自分で調べて分かりましたが、このBSAは、 > > pH5.2のものと、pH7.0 のものの両方が販売されています。 > > これらは使い分けはあるのでしょうか。 Globulin Freeかどうかの違いはないでしょうか。ま、入っていても実験系によってはししょうはないでしょう。Monoclonal antibodyの培地をそのまま精製せずに使ったりもするくらいですし、ブロッキング剤としてFBSなどを使うこともあるようですから。ただし１００％大丈夫とはいえないし理由があってのその商品の選択である可能性は否定できなしですけども。 pHは１％の水溶液でのpHのようですね。実際はバッファーに溶かすので直接的にそのpHのためにおかしいということはないような気がします。中性に近いほうが安心ではあるかなと。 > > また、もう一つ余談で教えてください。 > BSAは非常に高価なため、ミルクを使うこともありますが、卵のアルブミンはブロッキング剤としては使われないのでしょうか。 > > ナカライ：01205-84　アルブミン、卵由来　は　5450円/250Gと、非常に安価です。 > 使われるかどうかと言われると使われていたのを見たことがない程度の事しか言えませんが、同様の発想はあるようで、以下の論文では使えているようです。 PMID: 7814047 わたしはブロッキングにPVPを使ってます。BSAより高くないですし。ほかにもいろいろブロッキング剤として使われるものもありますが値段で比較したことはありません。ゼラチン、カゼインとかでしょうか。salmon serumとかも使われたりするみたいですね。

(無題) 削除/引用 No.9544-4 - 2021/02/27 (土) 21:23:12 - cvghj Blocking剤検定３級を保有しているものです。 bufferによっては賛成タンパク質であるアルブミンを高濃度で溶かすとpHがやや下がることがあるのでpH7.0の方が安心です。pHの多少のズレはあまり問題にならない実験ならばどちらでもいいと思います。免疫染色やWesternとかだとpHの多少のズレはあまり気にしない人も多いと思いますが。（pH8.0くらいの方がpH7.4よりもいい感じで反応する抗体も結構あると聞くし） むしろ純度は重要かもしれない。たまに結構色がついていてヘモグロビンムかなあと思うことあります。電気泳動で98%以上の純度でもヘモグロビン小さ過ぎで多分ゲルから出るしわからないと思う。ヘモグロビンは一種のペルオキシダーゼだからそういうの使うとHRP系の検出ではBGが高くなるかもしれないです。 牛などの血清アルブミン(Albumin)と卵白アルブミン（Ovalbumin)は、同じ名前がついてますが基本的に関係ない別々のタンパク質です。（前者は血漿タンパク質としては例外的に糖鎖を持たないタンパク質ですが、後者は代表的な糖タンパク質です）1940~1960年代に、生体材料からのタンパク質の分離分画の過程で化学的な性質が似ていたのでとりあえずアルブミンと総称してそれがなんとなく継承されてるのだと思います。（グロブリンも同様です。）名前がつけられた当時と現在とでは、だいぶ事情が違うので仕方ないのですが。 もし価格的に安価で量を確保したいならFish gelatinもブロッキング剤として使えます。安価なSkim milkの普及に伴い最近は使用されることが少ないけど昔は汎用されてました。牛皮膚由来のgelatinは加温しないと非常に溶けにくいのが難点なのだけれど、Fishのgelatinについては常温の水溶液に比較的溶けやすいから好まれます。BSAやmilkと比べてBGは同等か低めですが、 ただし当たり前ですがコラーゲンが関係する実験には使用できません。

(無題) 削除/引用 No.9544-3 - 2021/02/27 (土) 20:21:40 - G25 > 卵のアルブミンはブロッキング剤としては使われないのでしょうか。 少なくともビオチン・アビジン系に使えないのは確かだろう。

(無題) 削除/引用 No.9544-2 - 2021/02/27 (土) 18:30:59 - こま 安さと実績で優先するなら、スーパーに行ってスキムミルクをかってくることを オススメする。 コラーゲン入りと無しと使い分けて。 両方買っても安いし、コーヒーに入れて、自分で飲んだりもできる。

ブロッキング剤としてのBSAの、pHの違い pH7.0 or pH5.2 削除/引用 No.9544-1 - 2021/02/27 (土) 17:43:20 - 素人院生 お世話になります。 些細なことなのですが、教えてください。 ウエスタンブロッティングのブロッキング剤としてBSAを使用しています。 当研究室では、ナカライ： 01281-26 、 Albumin, Bovine Serum, Globulin Free , pH 6.5 - 8.0, 37,900円 を使用するように指導されました。 （もちろんミルクを使うこともあります） BSAはコーンの分画法というもので作られていると、自分で調べて分かりましたが、このBSAは、 pH5.2のものと、pH7.0 のものの両方が販売されています。 これらは使い分けはあるのでしょうか。 また、もう一つ余談で教えてください。 BSAは非常に高価なため、ミルクを使うこともありますが、卵のアルブミンはブロッキング剤としては使われないのでしょうか。 ナカライ：01205-84　アルブミン、卵由来　は　5450円/250Gと、非常に安価です。 もし宜しければ教えてください。

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