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免疫沈降の際のバンドの位置について トピック削除
No.9568-TOPIC - 2021/03/09 (火) 15:44:00 - maru
よろしくお願いいたします。

HA-Ras
HA-タンパクA(約40kDa)
FLAG-タンパクB(約60kDa)

Ras＋−でのタンパクAとタンパクBの結合を見るため、N末にタグをつけたプラスミドを作成し、PEIを使って293Tに以下の組み合わせで過剰発現させ、FLAGでIP、HAで検出を行いました。

１、タンパクA
２、タンパクA＋タンパクB
３、タンパクA＋Ras
４、タンパクA＋タンパクB+Ras

結果、FLAG-タンパクBを発現させたIPのレーン（２，４）で60kDaのところにはっきりとしたバンドが検出されてしまいました。
totalのレーンでは、40kDaのみでバンドが検出されました。

もしタンパクAとタンパクBが結合していたら、タンパクAの分子量である40kDaのところでバンドが認められるはずだと思います。

また、FLAGで検出を行った際は、total, IPともに２，４番で60kDaのところにバンドが検出されました。HAで検出されたバンドと全く同じ位置だったため、おそらくHAで検出されたのもタンパクBのバンドだと思います。

FLAGつきのプラスミドがHAで検出される、ということはありえるのでしょうか？
　
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(無題) 削除/引用
No.9568-5 - 2021/03/10 (水) 23:46:31 - gy
スメアになるのが特徴ならば, SDS-PAGEで見えるくらい大きく分子量が変わるようなタイプの修飾を受ける可能性は十分考慮すべきかも知れない。文献的に調査して、タンパク質Aは糖鎖、ポリユビキチン化、モノユビキチン化, UBLs、SUMO-1 化、ーーーーとの関連はないですか。

(無題) 削除/引用
No.9568-4 - 2021/03/10 (水) 04:06:52 - おお
>FLAGつきのプラスミドがHAで検出される、ということはありえるのでしょうか？

これについてちょっと思いついたので、
まず、両タグ間のクロスリアクトは基本ないと思ってます。
ただし、蛋白が大量にある時、結構な頻度で非特異的吸着がある場合があります（いろいろな抗体で）。例えばマーカーが反応してしまうとか、マイクログラムオーダーでBSAを流すとBSAに対しての抗体じゃないのに、反応してバンドが出てしまうとか。

こういったばあいこれという解決方法は提示できないのですが、Stringencyが上げれるような工夫が必要なときもあります。

そういえば蛋白Bのみ（FLAGのみでHAなし）をやってないですね。その系でやると上記のことが起こっているか見ることができるかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.9568-3 - 2021/03/09 (火) 16:25:42 - maru
おおさん

タンパクAのバンドはスメアのように検出されることが特徴なのですが、（totalではそのように検出されています）HAで検出されたIPフラクションのバンドはFLAGで当てた時と同じく一本の綺麗なバンドでした。先生に聞いた時も、どう見てもFLAGのバンドなのではと言われてしまいました。

＞HAかタンパクA特異的な抗体でIPしてFLAGで検出
＞FLAG IPのフラクションをタンパクA特異抗体でWB

ご提案いただいた方法につきまして、ぜひ検討してみたいと思います。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.9568-2 - 2021/03/09 (火) 15:59:29 - おお
修飾の可能性はあるかもしれませんけど、そのデーターだけだとそう言い切るのは難しいかもしれませんので、HAかタンパクA特異的な抗体でIPしてFLAGで検出してみてはどうでしょうか。

あるいはFLAG IPのフラクションをタンパクA特異抗体でWBするとか。

免疫沈降の際のバンドの位置について 削除/引用
No.9568-1 - 2021/03/09 (火) 15:44:00 - maru
よろしくお願いいたします。

HA-Ras
HA-タンパクA(約40kDa)
FLAG-タンパクB(約60kDa)

Ras＋−でのタンパクAとタンパクBの結合を見るため、N末にタグをつけたプラスミドを作成し、PEIを使って293Tに以下の組み合わせで過剰発現させ、FLAGでIP、HAで検出を行いました。

１、タンパクA
２、タンパクA＋タンパクB
３、タンパクA＋Ras
４、タンパクA＋タンパクB+Ras

結果、FLAG-タンパクBを発現させたIPのレーン（２，４）で60kDaのところにはっきりとしたバンドが検出されてしまいました。
totalのレーンでは、40kDaのみでバンドが検出されました。

もしタンパクAとタンパクBが結合していたら、タンパクAの分子量である40kDaのところでバンドが認められるはずだと思います。

また、FLAGで検出を行った際は、total, IPともに２，４番で60kDaのところにバンドが検出されました。HAで検出されたバンドと全く同じ位置だったため、おそらくHAで検出されたのもタンパクBのバンドだと思います。

FLAGつきのプラスミドがHAで検出される、ということはありえるのでしょうか？
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