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(無題) 削除/引用 No.9615-12 - 2021/04/21 (水) 04:28:44 - おお >[Re:9] トランスさんは書きました : > まずDNAからPCR阻害物質を抜くことや、 > 阻害物質に強い酵素を使ったPCRを考えてみたら。 > > その抽出したDNAを材料に、もう一回、抽出するだけでも > 阻害物質を減らせる。 今更だけど、質問から多分阻害物質に関する研究のように感じられる。

(無題) 削除/引用 No.9615-11 - 2021/04/15 (木) 11:43:17 - G25 阻害物質なんか心配ない普通のPCRでも、ちょっと手強い標的だと、プライマーの設計や条件設定をよく最適化しないと同じようなことは起こりうる。

(無題) 削除/引用 No.9615-10 - 2021/04/15 (木) 11:39:29 - G25 たぶんBSAとか関係なくて、仮に阻害物質を排除できたとしてBSA抜きで同じようにPCRかけても同じことが起こると思う。

(無題) 削除/引用 No.9615-9 - 2021/04/15 (木) 09:57:20 - トランス まずDNAからPCR阻害物質を抜くことや、 阻害物質に強い酵素を使ったPCRを考えてみたら。 その抽出したDNAを材料に、もう一回、抽出するだけでも 阻害物質を減らせる。

(無題) 削除/引用 No.9615-8 - 2021/04/15 (木) 09:07:04 - おお テンプレートに使うDNAが多くてバンドが見えているってことはないですよね。

(無題) 削除/引用 No.9615-7 - 2021/04/15 (木) 07:24:36 - G25 PCR産物の濃度が高まっている状態で過剰にサイクルを繰り返すと、鋳型にプライマーがアニールするだけでなく、鋳型鎖同士の会合が起こりやすくなります。この時、鋳型分子の3‘末端が別の鋳型分子の内部配列にアニールして鎖の伸長が起こることがあります。キメラ的に長くなった鎖ができるわけです。これが繰り返され、またプライマーで増幅したりすることでキメラ的な重合体が増えてきます。

(無題) 削除/引用 No.9615-6 - 2021/04/15 (木) 04:23:06 - おお https://www.bio-rad.com/en-us/applications-technologies/pcr-troubleshooting?ID=LUSO3HC4S ＞primer dimerなら100bp未満のはずですが、 primer がダイマー作りやすいのならprimer dimerもダイマーを作りやすいです。最終的に安定な長さのプロダクトができるならば、長さはプライマーによって様々でしょう。個人の経験ですがラダーが現れたことがあります。TemplatesとのミスアニーリングによるProductsが加わるともっと複雑になります。

(無題) 削除/引用 No.9615-5 - 2021/04/15 (木) 00:07:23 - DFN BSA単独で流すとバンドは見えません。cell culture用のBSAも試しましたが、バンドはありません。 ＞特異的なPCR産物しかできない系でも産物の重合体が生じて高分子量の不正な産物ができます。 重合体というのは具体的には、どういう物質でしょうか？primer dimerなら100bp未満のはずですが、、、300bpの目的産物以外に1500bp程度にスメア領域が見えます

(無題) 削除/引用 No.9615-4 - 2021/04/14 (水) 19:20:59 - G25 同じ系でtemplateを入れずにPCRをかけてみては？　BSA抜きの反応を対照として。 反応のサプリメントとして入れるとき、わたしは、制限酵素におまけで付いてくるBSA溶液を使います。制限酵素消化でもそんなに使うもんでもないので、結構、貯まって、それ用に買ったり調製したりしなくていい。 PCRのサプリとしての他に、テンプレートやプライマーを希釈するときにも、吸着ロスでブレるのを抑えるためのキャリアーとしても使うことがある。 そういった経験の限りでは、BSAが原因でおかしなPCR産物が生じたことはなし。 >その後精製を行うと、高分子領域にもバンドが見られます。 単に反応後普通に、電気泳動して見たわけじゃなく、精製後に見たらそうなっていたということでしょうか？　精製前に普通に電気泳動してもやっぱり変ですか？　（精製によるartifactという可能性も考えて） それと、サイクル過剰だったりすると、特異的なPCR産物しかできない系でも産物の重合体が生じて高分子量の不正な産物ができます。その可能性はないのかな？ 阻害物質を緩和するサプリとしては、ほかにPVAとかPVPなんかが知られていたと思います。生物由来のBSAが悪さをするということなら、ケミカルなサプリを試してみては？　最近のよくある、PCR用酵素に添付のトロミのあるバッファーはPVAかなんかが入っているんじゃないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.9615-3 - 2021/04/14 (水) 03:55:33 - メカ グレードによっては、ウシDNAがたっぷり。

(無題) 削除/引用 No.9615-2 - 2021/04/14 (水) 00:53:52 - おお BSA単独で流してみたら？ BSAはいろんな商品が出回っているので一概にこうだと言えないけど、制限酵素についてくるようなBSAはDNAコンタミしてたらLigationしたら大変なことになる。Molecular biology gradeなら大丈夫そうだけどSpecificationや商品説明を確認してみるといいとおもう。 PCRをふくめたMolecular biologyでBSAはまあまあの頻度で昔から使われてきているので、しっかり対応したものは見つかるはず。もし参考にしたプロトコールにBSAがどの商品か明記してたらそれを使うのが無難だと思う。

BSA 削除/引用 No.9615-1 - 2021/04/13 (火) 23:00:47 - DFN とあるPCR阻害物質を含むDNA溶液をテンプレートにPCRを行っています。 プロトコールに従い、BSAを加えながらPCRを行い、目的産物を得ているのですが、その後精製を行うと、高分子領域にもバンドが見られます。 BSAにはDNAのコンタミはあるのでしょうか。

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