全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.9623-12 - 2021/04/17 (土) 11:31:51 - toto たしかにmedpfさんの言われるように、発現のばらつきはありますね。レンチのパッケージング細胞のFACSは、しばかれるのでやったことありませんが、顕微鏡画像で見ると、発現量のばらつきは一桁くらいはあります。 GFPさんの目的はレンチ作成で、titerをあげたいということですよね。それであれば、transfectionするときの293Tのconfluencyを8−9割くらいにして、蒔いてから4-8時間内にtransfectする、8-16時間の時はtransfectionの1時間前に培地を交換する、などの細かい工夫をしてます。これで大体、使えるくらいのウイルスができてます。もちろんベクターさえ問題なければですが。

(無題) 削除/引用 No.9623-11 - 2021/04/17 (土) 07:02:12 - medpf 293Tへの導入効率だけなら、皆さんおっしゃっているようにほぼ100%近く入ると思いますが、トピ主さんが気にされているのは、強発現するのが10%くらいで、残りの90%はmockと比べて１logシフトくらいの比較的低発現になってしまう事についての懸念ですよね。 まずは、お使いになっているプラスミドの情報（SV40oriが入っているかどうか、プロモーターは何か、など）があれば、皆さんご自身の経験と比較しやすいと思います。SV40oriが入っているなら、No.9623-4「とおりすがりのもの」さんの案（G418で培養してから再トライ）を試してみる価値があるように思います。 個人的には、GFP融合蛋白の発現ベクターをPEIで293Tに入れた時に、同じような経験（ほぼ100%近くはいるけど、そのうち８割ほどの細胞が比較的低発現）した事があります。ベクターにはSV40oriが入ってましたので、プロモーターと融合蛋白の組み合わせが悪いのかなぁと思いましたが、実験自体に支障がなかった（コンフォーカルで十分光って見えた）ので、深掘りしてません。 レンチウイルスのパッケージング目的のトランスフェクションなら、タイターに問題なければそれで良いように思います。この場合、例えば10%のtri-transfectionされた細胞（強く光る）から産生されたウイルスが周囲の細胞に感染して弱く光る（残りの90%）というような事も起こり得るかもしれません。個人的にはウイルスを産生する293TをFACSにかけた事がないので、推測の域を出ませんが。

(無題) 削除/引用 No.9623-10 - 2021/04/16 (金) 13:24:32 - PEI 私もCMV prompter-GFPをPEIで293Tに発現させたら顕微鏡で見た感じ100％ビカビカに光っててFACSでみたら8〜9割陽性な感じです。

(無題) 削除/引用 No.9623-9 - 2021/04/16 (金) 11:37:53 - 散々 PEIといえば日本触媒。 通常、荷姿　石油缶(18kg)、ドラム缶(200kg)で売られているものだけど、 頼み方次第でサンプルを分けてくれる。 https://www.shokubai.co.jp/ja/products/detail/epomin1.html 和光から研究用試薬として買っても、30%液で1kg 4000円。 通常の実験ならこれで十分。 どの規格の分子が最も有効かは細胞種に依る。 https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/result/product.html?fw=%E3%83%9D%E3%83%AA%E3%82%A8%E3%83%81%E3%83%AC%E3%83%B3%E3%82%A4%E3%83%9F%E3%83%B3

(無題) 削除/引用 No.9623-8 - 2021/04/16 (金) 10:03:41 - ｆ 余談ですが、PEI は残念ながら非常に高価なものになってしまいましたね・・・。 https://www.cosmobio.co.jp/product/detail/psi_20120517.asp?entry_id=9269

(無題) 削除/引用 No.9623-7 - 2021/04/16 (金) 09:58:24 - toto ２９３ＴにGFP等のプラスミドをPEIを使って、昨日も入れましたが、九割くらいの細胞にはいりますよ。100％にはなりませんが。どの２９３でもPEIでそれくらい入ります。有名なのは、タンパク質科学会のプロトコールで、タンパク質科学会アーカイブス 1, e017 (2008) で検索してみてください。PEIは100mLで1万五千円という一度買うと生涯持つような安いものです。これは結晶作成用のＬ単位の大量調製のために作られたプロトコールですが、もちろんスモールスケールでも同じです。発現後、16時間で十分ひかり、2日目になるとがんがんに光ってます。

(無題) 削除/引用 No.9623-6 - 2021/04/16 (金) 09:22:42 - GFP ＞とおりすがりのものさま、おおさま ありがとうございます。 pH調整が必要なのですね... 一度試してみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.9623-5 - 2021/04/16 (金) 07:10:58 - おお >[Re:3] GFPさんは書きました : > > おお先生はGFPを導入してフローサイトは行われたことはありますでしょうか？ > その際のGFPの発現分布を見られましたでしょうか？ ないですねぇ。。。

(無題) 削除/引用 No.9623-4 - 2021/04/16 (金) 05:30:57 - とおりすがりのもの リン酸カルシウム法は自分でpH細かく振って最適化したほうが良いと思います。 SV40TがG418耐性で入っているはずなので、プラスミドを入れる前に293TをしばらくG418入れて飼っていたらどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.9623-3 - 2021/04/16 (金) 01:58:01 - GFP おお先生 リン酸カルシウム法は使ったことはなく、むしろout datedなものだと思っていました。 無知が恥ずかしいです。ありがとうございます。 確かラボにinvitrogenかどこかから購入したリン酸カルシウム溶液があったと思いますので、一度試してみたいと思います。 おお先生はGFPを導入してフローサイトは行われたことはありますでしょうか？ その際のGFPの発現分布を見られましたでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9623-2 - 2021/04/16 (金) 01:38:59 - おお HEK293TなどHEK293系の細胞はリン酸カルシウムが一番効率がいいです。なのでレンチ作成プロトコールもリン酸カルシウム法を記載しているものがまあまああると思います。デメリットはちょっとした条件のブレで導入効率が大きく変わるというところです。 PEIとLipofectamineの比較はしてませんが、両者ともHEKで発現したいものを導入すると実験できるレベルで入ってはいると思ってます。

GFP 削除/引用 No.9623-1 - 2021/04/16 (金) 00:39:16 - GFP GFPを293TにPEIを用いてトランスフェクションしています。 FACSで5x10^4あたりにつよいGFPシグナルを認めるものが10％ほど、残りは10^3ほどにGFPの蛍光強度を示すものが分布しています。mockをトランスフェクションしたものでは10^2あたりがGFP検出のバックグラウンドになります。 Lipofectamineは高価なので使ったことがありませんが、もっと8-9割くらいの細胞がガツンとGFPが陽性になるものと思っていました。PEIでもLipofectamineでもこういうものなのでしょうか？ 蛍光顕微鏡で見ても確かに強いものもあればぼんやりGFPが光っているものもありました。 あるいは細胞がへたっているのか、試薬がヘタっているのか、トランスフェクションの条件が適切ではないのかが分からないでいます。特に実験には支障はありませんが、私のトランスフェクションが不適切であれば、そこを改善して、例えばレンチウイルス産生量をあげられるのではないかと期待しています。 HEK293T細胞へのトランスフェクションを行なっておられる先生方がいらっしゃいましたら、ご助言いただけますと幸いです。

全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---