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(無題) 削除/引用 No.9888-25 - 2021/09/10 (金) 18:51:53 - YXY よくよく培養細胞の遠心の影響を調べてみると、完全に死に至った細胞が一番重くて、次に生きた細胞、最後に断片化した死細胞が来るようです。 遠心しないでもdish中で軽くふってもそういった傾向がありそうです。 うーん、たちが悪い。 継代の際に、しっかり遠心をしないと生きた細胞が若干除去されることがありそうです。

(無題) 削除/引用 No.9888-24 - 2021/09/04 (土) 10:43:55 - ゆ L-glutamineは安定性があまり良くないので培地を大人買いして長期保存してるとことかは使うときに入れたいという人もいるので、抜きで売ってたりします。また熱に弱いのと、壊れるとよろしくない産物ができるので、粉末培地から溶かしてオートクレーブ滅菌するような場合にぐるたみん入りだと都合が悪いので、それでわざと抜いてたりとかします。古い培地使ったら増殖が悪いときとかはぐるたみんが減ってきたのが原因とかはよくあります。 基本的に培地のボトルに書いてある消費期限は守ったほうがいいです。

(無題) 削除/引用 No.9888-23 - 2021/09/04 (土) 06:59:29 - YXY ＞一応してみたらどうですか？ロットチェック用サンプルはもらえるから。現に細胞の調子が（そういうものかもしれませんけど）パーフェクトではないのですから。 バッチでの購入をしないラボですので、ロットチェックは行ってきませんでした。また、ある程度大手のものは、Bulk生産のため、近年はロット差は少ないという話も聞いているのですが、経験者の方からすると、やはりあるのでしょうね。 ＞グルタミンの件ですが、培養中に徐々に分解して毒性のあるアンモニアを発生すると言われてます。そのため分解しにくいGibcoのGlutaMax （L-alanine-L-glutamine）などを使うこともあります。 私が使っているmediumはグルタミンが予め入っているため、さらに追加で付加する意義があるのか、少し考えたいと思います。もちろん元の濃度が薄ければ、付加した方がいいのかもしれませんが、成分を調べたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.9888-22 - 2021/09/04 (土) 01:05:32 - おお >[Re:19] YXYさんは書きました : > 血清のロットチェックはしていませんね。他の接着細胞では全く問題が出ていないのですが、血清のロットと培養細胞の相性はやはり常に気にしないといけませんかね？ > 一応してみたらどうですか？ロットチェック用サンプルはもらえるから。現に細胞の調子が（そういうものかもしれませんけど）パーフェクトではないのですから。 グルタミンの件ですが、培養中に徐々に分解して毒性のあるアンモニアを発生すると言われてます。そのため分解しにくいGibcoのGlutaMax （L-alanine-L-glutamine）などを使うこともあります。

(無題) 削除/引用 No.9888-21 - 2021/09/03 (金) 18:13:44 - YXY アドバイスありがとうございます。 ＞FCS量を増やすとかどうですか？血球系は20%で培養することもよくある。 データシートが10%なので、増やす勇気はなかったのですが、このあたりも検討した方がいいのかもしれないですね ＞あとフラスコではなく24 well plateなどで比較的密にして培養するなど。フラスコだったら立てて培養するとか。 ある程度大容量での培養を目指しています。比較したことはないのですが、small scaleで増殖効率が目に見えて高いイメージは今のとことはないです。 が、、、考えてみると、死細胞の割合が高くなって、何をもって密度というのも問題な気がしてきました。。。

(無題) 削除/引用 No.9888-20 - 2021/09/03 (金) 16:51:58 - mp FCS量を増やすとかどうですか？血球系は20%で培養することもよくある。あとフラスコではなく24 well plateなどで比較的密にして培養するなど。フラスコだったら立てて培養するとか。

(無題) 削除/引用 No.9888-19 - 2021/09/03 (金) 15:33:04 - YXY 私が使っている会社のmediumはL-glu入っていますが、他の研究者のは入っていないmediumを使っている可能性があるということですかね。 比較的マイナーな細胞のため、名前は差し控えたく思います。 血清のロットチェックはしていませんね。他の接着細胞では全く問題が出ていないのですが、血清のロットと培養細胞の相性はやはり常に気にしないといけませんかね？

(無題) 削除/引用 No.9888-18 - 2021/09/03 (金) 14:13:13 - おお L-glutamineは必須アミノ酸ではありませんが、培養には必須といってもいいぐらいの成分です。培地の中に入っているものですが、（たぶん分解しやすいなどの理由で）グルタミンを抜いた培地を売っていて、使うときにグルタミンをボトルに加える用になっている培地もあります（論文で加えているのはグルタミンフリーの培地を使っているからかもしれません）。グルタミンを抜いた培地をそのまま使うとほとんど増殖せずに調子が悪くなることがたいていです。グルタミンは簡単なステップでTCAサイクルに入ることができるので培養ではエネルギー生産（ATP合成）にかなり寄与していると思えますが、その他の役割もあるのかもしれません。 ピルビン酸についてはなくてもいいでしょうけど、入れたほうが生理的に安定することもあるようです。TCAサイクルの活性化で使っているのかもしれませんが、ミトコンドリアDNA合成を阻害して作った、ミトコンドリア欠損（完全に欠損しているかといえば疑問だけど）株を維持するのに使われているようです。 またnucleosidesを入れた培地が使われることもあります。ESとかTetratoma（ESのように分化が可能で、ESが樹立されてないときはそういう細胞でTransgenicを作っていた。） でよく使われてるようです。 たとえば、 https://www.thermofisher.com/us/en/home/technical-resources/media-formulation.94.html 血清のロットチェックはしましたか？ あと、細胞株の名前が開示できるなら具体的なアドバイスがもらえるかもしれませんよ。てっきり自身で樹立したとか、マイナーで売ってもない細胞なのかと思ってました。

(無題) 削除/引用 No.9888-17 - 2021/09/03 (金) 12:25:08 - YXY みなさん、アドバイスをいただきありがとうございます。 機器や試薬を用いた、分離方法のアドバイスありがとうございます。他にもいい試薬がありましたら、教えていただきたく思います。FicollとDead cell kitは候補に入れたいと思います。 いくらこれらの分離手法が有用だと言っても、培養方法自体が重要なのは間違いないので、一度細胞培養の話に戻りたいのですがよろしいでしょうか。 扱っている細胞株のATCCのデータシートでは、FBSの添加以外の記載はないのですが、論文検索を行うと、L-glutamineやピルビン酸を加えている研究者が、まま、います。 こういったものの付加はどれほどの効果があるのでしょうか。必須アミノ酸云々や、増殖期をサポートするなどの効果はわかるのですが、データシートに記載されていないものを付加して意義があるのか、あるいは、何らかのside effect（分化度に影響を与える等）も完全には否定しきれないと愚考しています。

(無題) 削除/引用 No.9888-16 - 2021/09/03 (金) 02:13:04 - おお >[Re:9] YXYさんは書きました : > 普段の継代培養でできる工夫がもしあれば、教えていただけると助かります。 > > PIとannexinでFACS sortingすれば当然完全分離に近いことができることは把握しております。 > > できれば培養の段階では、何らかの化学物質での処置はしたくありません。 https://www.bio-rad-antibodies.com/blog/a-guide-to-gating-in-flow-cytometry.html Forward, side scatter density plotをつかったらケミカルなどはいらないんじゃないか？ まあソーティングじしん細胞に負担がかかるらしいけど。

(無題) 削除/引用 No.9888-15 - 2021/09/02 (木) 12:59:53 - YXY アドバイスありがとうございます。 Dead cell removal kitは初めて知りました。 磁器ビーズで分離するとのことで、化合物等の影響はやや心配ではありますが（実験中に、細胞の分化のステップを挟みますので）、ここぞという実験に有用に見えます。 死細胞を限りなく減らすために、継代に関しても、限りなく、規則的にして、抗生剤もなしで培養するところから始めようとは思っています。 遠心のrpm数に関しては検討していて、rpmが少ないと生細胞が浮き上がり、rpmを多くすると死細胞が沈みます。死細胞由来の欠片はうまく取り除けるのですが（顕微鏡下で上澄みを観察）、死細胞の本体は常についてまわります。たちが悪いのが、死細胞やゴミが生細胞を破壊しているように見えることもあり、継代作業を繰り返したからと言って、生細胞の割合が増えるわけでもないのが、難点です。

(無題) 削除/引用 No.9888-14 - 2021/09/02 (木) 03:46:55 - おお >[Re:13] miloさんは書きました : > 主に肺小細胞がんを使いました。... 白血病細胞でも試しましたが（こちらは通常に培養していたとき）同じです、多少デブリは取れたような気がしましたが ありがとうございました。うまく行かないときは全然なのですね。 死細胞も軽くなるかもしれませんけど、Apoptotic bodyみたいに凝縮塊ができると逆に重くなるだろうし、そういうのがうまく分けられないと意味がないのかもしれません。 他の方のうまく行った例も詳細に聞きたくなりました。

(無題) 削除/引用 No.9888-13 - 2021/09/02 (木) 02:37:59 - milo 主に肺小細胞がんを使いました。薬剤耐性細胞を作ろうと思っていたのですが、デブリスが邪魔だな、と思いなんとか仕分けしたいと思っていました。遠心をゆっくり短くするですとかFicoll分離を試してみたのですが、多少のデブリは取れましたが結局下に落ちてきます。白血病細胞でも試しましたが（こちらは通常に培養していたとき）同じです、多少デブリは取れたような気がしましたが結局大部分は落ちてしまいました。細胞の種類を変えてうまくいく細胞を見つけようですとか、FicollやPercollの分離剤の種類ですとか、そこまでの比較検討はしておりません。うちにMiltenyibiotecの磁石の分離キットがあるのでデッドセルリムーブキットを使ったほうが早いねという結論になりました。もちろんカラムやキットのコストがかかるのでいつもやっているわけではありませんが、浮遊細胞を使っている場合は必要に応じて用いることにしています。正直このようなソーティング系でしか分離できないと思っています。簡便な方法のアイデアがあるといいなとは思いますが。

(無題) 削除/引用 No.9888-12 - 2021/09/02 (木) 02:18:44 - おお コラーゲンとかフィブロネクチンとか（細胞によってどれがいいかとかあると思うけど）でコートしたDishなどで１日ほど培養して底についているものを集めるというのはどうだろうか。あるいはそういうDishで接着細胞として飼い続けるとか。

(無題) 削除/引用 No.9888-11 - 2021/09/02 (木) 02:08:22 - おお >[Re:7] miloさんは書きました : > うまくいきません。正直時間の無駄です。 miloさんははどのような細胞でうまく行かなかったのでしょうか？質問されている方へのヒントになるかもしれませんし、このサイトを情報ソースと考えたとき有用な情報かと思いますので。

(無題) 削除/引用 No.9888-10 - 2021/09/01 (水) 19:08:42 - こま 浮遊系細胞ということは血球系ですかね？ 私はいくつかの血球系細胞株に対し、ルーチンで凍結ストック解凍後に出る死細胞を除去するのにFicollで分離してますけど、たいていの細胞株ならいけるのでは？

(無題) 削除/引用 No.9888-9 - 2021/09/01 (水) 13:47:40 - YXY 普段の継代培養でできる工夫がもしあれば、教えていただけると助かります。 PIとannexinでFACS sortingすれば当然完全分離に近いことができることは把握しております。 できれば培養の段階では、何らかの化学物質での処置はしたくありません。

(無題) 削除/引用 No.9888-8 - 2021/09/01 (水) 06:12:01 - mp ficolは細胞によってはうまくいく。 ソーティングが確実と思うけど、いちいちやるのもね。

(無題) 削除/引用 No.9888-7 - 2021/09/01 (水) 02:51:07 - milo うまくいきません。正直時間の無駄です。

(無題) 削除/引用 No.9888-6 - 2021/09/01 (水) 02:45:24 - おお >[Re:5] miloさんは書きました : > Dead Cell Removal Kitを使うしかありません。 FicollやPercollではうまく行きませんか？

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