全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.9904-14 - 2021/09/27 (月) 09:33:55 - おもいつかない compensation beads の標識においては、蛍光標識が同じ別の抗体に交換することが可能ですので、今回問題が発生している PE-Cy7/PerCP-Cy5.5 の抗体の組み合わせの他に、例えばPE-Cy7の抗体を全く関係のない抗原に対する抗体に入れ替えてみるとか、様々に試していただくことが、可能ではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.9904-13 - 2021/09/27 (月) 09:22:15 - おもいつかない >ZE5はBiexponential表示はできないものの負にも表示を広げることは可能です。それはつまりネガティブ集団を正にするために無理にVoltageを上げるよりも、負でもいいからVoltageを下げることに専念しろという理解で正しい出ようか？ voltage を下げるのが重要というよりは、compensation matricesの最適なバランスを与えてくれる voltage にまず設定することが重要である、という意味合いでした。それを犠牲にして voltage を上げるのは必ずしもよくないと思います。(お使いのフローサイトメーターとそのソフトウェアの特性というのもあり、操作しづらい部分もあるかもしれませんが) データ取得後の解析にもし FlowJoを用いられていれば、そこで biexponential displayはできるのではないかと思います。そこで問題がなければ、論文として投稿するデータにおいても大丈夫かと思います。 > お恥ずかしながら教えてください。これにはどのような意味合いが込められているのでしょうか？両標識のポジティブ集団の割合がall eventに対して非常に低い場合はあまり効果がないように思えてしまうのですが、認識は誤っていますでしょうか？ 繰り返し申し上げておりますが、私はデータのプロットを拝見していない立場であれこれ思案しております。データのプロットをご覧になっている方と情報を共有していないので、厳しい追求をいただいてもお答えするための情報がありません。たけい様がお使いの細胞が PBMCなら、そこには単球がいるでしょうし、全血であれば好中球もいると思います。マウスの脾臓や骨髄細胞であれば、実験条件によっては自家蛍光が発生することもあるかもしれません。たけい様が「それは意味がない」と先入観にて決めつけているのではなく、「意味がないことを既に確認済みである」ということであれば、それでよろしいのではないでしょうか。

Re:おもいつかない様 削除/引用 No.9904-12 - 2021/09/27 (月) 00:39:32 - たけい ＞一般論としては、無理矢理ポジティブ集団をゲートしたら hoge % になるはず、というのは厳しいとは思います。両方標識して double positive が出てこないなら、 0% と表記するのが一般的ではあると思います。 ＞斜めに尾を引くけど double positive が出てきていない、と表現されている減少も。 無理矢理算出するのは難しいとのこと、承知致しました。 それではどうにか解析できるように工夫を凝らしてみようと思います。 (漏れこまない蛍光の組み合わせにして再実験するしかないかもしれませんが、、、) ＞ちなみに、「斜めに尾を引く」というのは「2つのシグナルが比例関係にある」という意味でしょうか? おっしゃる通りです、X蛍光値の増加に比例してY蛍光値も増加していきます。(漏れこんでいる場合のCompensation前のような状態です) ＞biexponential display ではゼロのどれくらい下まで目盛を読むか、設定を変更できるのではないかと思います。仮に軸が -10^2までで、細胞が張り付いていたとしても、-10^3まで表示するように設定を変更すれば、軸に貼り付かなくなるのであれば、それで問題がない場合もあります。無理に voltage で軸から剥がす必要は無いかと思います。 ZE5はBiexponential表示はできないものの負にも表示を広げることは可能です。 それはつまりネガティブ集団を正にするために無理にVoltageを上げるよりも、負でもいいからVoltageを下げることに専念しろという理解で正しい出ようか？ ＞1. singlet や生細胞のゲーティングをせず、all events に対し両軸を PE-Cy7/PerCP-Cy5.5 にした場合にどのように見えるか お恥ずかしながら教えてください。 これにはどのような意味合いが込められているのでしょうか？ 両標識のポジティブ集団の割合がall eventに対して非常に低い場合はあまり効果がないように思えてしまうのですが、認識は誤っていますでしょうか？ ＞2. compensation beads を PE-Cy7のみ標識、PerCP-Cy5.5のみ標識、PE-Cy7/PerCP-Cy5.5両標識 した3サンプルを作成し、とり込んだときに、期待される正常なプロットが見えるかどうか。 Beadsを二つの標識で同時に染めることはお恥ずかしながら頭にありませんでした。Compensation値が適切か否かが見える気がしてきました。ありがとうございます、さっそく試させて頂きます。

(無題) 削除/引用 No.9904-11 - 2021/09/26 (日) 18:09:06 - おもいつかない 現時点で思いつくこと (あくまでプロットを拝見していない、という条件で) 1. singlet や生細胞のゲーティングをせず、all events に対し両軸を PE-Cy7/PerCP-Cy5.5 にした場合にどのように見えるか 2. compensation beads を PE-Cy7のみ標識、PerCP-Cy5.5のみ標識、PE-Cy7/PerCP-Cy5.5両標識 した3サンプルを作成し、とり込んだときに、期待される正常なプロットが見えるかどうか。 3. 他のフローサイトメーターで確認することは可能かどうか 4. 同一抗体の異なる標識の製品ではどのようなプロットが見えるか 5. 同一抗原を標的した抗体の、別のクローンを用いるとどのようなプロットが見えるか 私の立場ではこのように列挙してみるしかありませんが、いずれにしても、現在直面している現象に対して、なんらかの方法で再現を試みることが重要だと思います。再現性の発見は、問題の解決に大きく近付きます。

(無題) 削除/引用 No.9904-10 - 2021/09/26 (日) 17:56:36 - おもいつかない >私が申し上げたネガティブ集団が軸に貼り付かない程度というのはCompensation controlデータ取得時のことです。そうなるようにVolategeを調節しています。 こちらですが、Bio-Rad ZE5 では biexponential の設定は可能でしょうか? biexponential display を使用されている場合、軸への貼り付きを voltage で調整することは一般的では無いように思います。 biexponential display ではゼロのどれくらい下まで目盛を読むか、設定を変更できるのではないかと思います。仮に軸が -10^2までで、細胞が張り付いていたとしても、-10^3まで表示するように設定を変更すれば、軸に貼り付かなくなるのであれば、それで問題がない場合もあります。無理に voltage で軸から剥がす必要は無いかと思います。

(無題) 削除/引用 No.9904-9 - 2021/09/26 (日) 17:48:09 - おもいつかない たけい様 > FMO Control同士の差分から無理矢理ポジティブ集団をゲートすることは解析上間違っておりますでしょうか (おそらくCompensationの不適によりhigh/highが右上に出てこない)？ やはりプロットを見ないと正確に分かりませんが.... ビーズで設定されているなら、compensation の問題以外の問題を考慮に入れるのかなぁ...と思います。 一般論としては、無理矢理ポジティブ集団をゲートしたら hoge % になるはず、というのは厳しいとは思います。両方標識して double positive が出てこないなら、 0% と表記するのが一般的ではあると思います。 (理論的に査読者を納得させられる場合を除く) また、斜めに尾を引くけど double positive が出てきていない、と表現されている減少も。図なしでは少し理解が難しいかもしれません.... ちなみに、「斜めに尾を引く」というのは「2つのシグナルが比例関係にある」という意味でしょうか? もしそうでありましたら、ここからまた一般論になりますが、2つのシグナルが比例関係になる原因として (1) 蛍光のもれこみが補正不可能なほど大きい (2)自家蛍光が発生している (3) 使用している2つの抗体の間に交叉反応性がある、などが考えられます。 今回ビーズで蛍光補正されているので (1) はらしくありません。また、自家蛍光が大きい細胞は骨髄球系細胞 (マクロファージ、DCなど)に多く、初代のリンパ球では (2) はさほどらしくありません。(3) に関しては確率はもちろん低いですが、個人的には一部の主にT細胞標識に用いる抗体製品で、交叉反応性と思しき比例関係に悩まされた経験は複数回あります。

Re:おもいつかない様 削除/引用 No.9904-8 - 2021/09/26 (日) 14:41:24 - たけい ＞ビーズで問題なくて細胞で問題がある場合、細胞の非染色、単染色(PerCP/Cy5.5のみ、またはPE/Cy7のみ)のサンプルを同時に用意し、両方染色したサンプルと比較してみてもいいかもしれません。 念のためFMO Controlは解析しております。 ですので、今回の解析の応急処置として、FMO Control同士の差分から無理矢理ポジティブ集団をゲートすることは解析上間違っておりますでしょうか (おそらくCompensationの不適によりhigh/highが右上に出てこない)？ 私が申し上げたネガティブ集団が軸に貼り付かない程度というのはCompensation controlデータ取得時のことです。そうなるようにVolategeを調節しています。もちろんCompensation後もovercompensationして軸に貼り付かない程度に値を調節しています。

Re:ema様 削除/引用 No.9904-7 - 2021/09/26 (日) 14:34:30 - たけい ＞ご利用の機器（搭載レーザー：フィルター）をお聞きしても良いでしょうか。 Bio-Rad社のセルアナライザーZE5です。405/488/640nmレーザー版、フィルター数は最大17color検出可能なものです。 ＞非特異的な蛍光かもしれませんので、これを逆にFSC/SSCのどの部分にあたるかは検証されていますでしょうか。 図説できれば良いのですが。 今回リンパ球を解析対象としておりますので、FSC low/SSC lowの一般的なリンパ球集団をゲートしております。 非特異的な除去としてFSC-H/FSC-W、SSC-H/SSC-Wのダブレット除去、Live/Dead染色のlow集団をとったDead除去もした集団において斜めに尾を引いた集団が観測されました。

(無題) 削除/引用 No.9904-6 - 2021/09/25 (土) 11:12:23 - おもいつかない 50%の蛍光もれこみが問題かどうかは、ケースバイケースです。 肝腎のデータが許容範囲のノイズで取得できていれば可、です。 30%でも肝腎のデータの精度に悪影響していれば不可、です。 ですので、現在の御自身のケースで個別にデータを検討していただく必要があります。

(無題) 削除/引用 No.9904-5 - 2021/09/25 (土) 11:09:44 - おもいつかない 心中お察しいたします。 compensation beads での設定を毎回されているということなので、少し具体的にうかがいますが、たとえば以下の数値はビーズでの設定後、どうなっておりますでしょうか。 PerCP/Cy5.5 のチャネルの voltage: PE/Cy7 のチャネルの voltage: PerCP/Cy5.5 - PE/Cy7 の compensation matrix (%): PE/Cy7 - PerCP/Cy5.5 の compensation matrix (%): この辺の設定が適切でなおかつ問題が出るばあい、別のご意見であるように、蛍光のもれこみとは別の問題があるかもしれません。ビーズで問題なくて細胞で問題がある場合、細胞の非染色、単染色(PerCP/Cy5.5のみ、またはPE/Cy7のみ)のサンプルを同時に用意し、両方染色したサンプルと比較してみてもいいかもしれません。 >いつもネガティブ集団が軸に貼り付かない程度にしています こちらの「軸に貼り付く」の意味にもよりますが、overcompensation で貼りつくのはダメです。一方、現在の FACSでは陰性分画の蛍光値としてマイナスの値が出力されることはありますが、それ自体は必ずしも問題ではなく、許容されることがあります。FACS Diva や FlowJo で biexponential display (分からなければ調べてみてください) をしている場合、ゼロの前後を綺麗に表示してくれます。ですが voltage と compensation matrix の設定は確実である必要がありますから、必要なら voltage を下げてみてください。 FACSの場合、図を使わないと伝わりにくい部分はありますね。現場で助けてあげることはできないかと思いますが、トラブルシュートを頑張っていただければと思います。

(無題) 削除/引用 No.9904-4 - 2021/09/24 (金) 17:24:07 - ema ＞yellowレーザー ＞設定変更 ご利用の機器（搭載レーザー：フィルター）をお聞きしても良いでしょうか。 結構yellowレーザーまで載せていない機種がありますので。 ＞斜めに尾 非特異的な蛍光かもしれませんので、これを逆にFSC/SSCのどの部分にあたるかは検証されていますでしょうか。 必要な細胞集団でなければ、外してFSC/SSCゲートをかけてきれいにすることは出来ると思います。

Re: 削除/引用 No.9904-3 - 2021/09/24 (金) 00:12:34 - たけい おもいつかない様 ご返答頂き誠にありがとうございます。 また返信が遅くなってしまい大変申し訳ございません。 ＞PerCP/Cy5.5 と PE/Cy7 との間で蛍光の漏れ込みが大きいのでしょうか。 この2 つだと、一般論としてそこまで重大なもれこみになるかは分かりませんが... おっしゃる通りです、私も予想外で驚きました。 もしかしたら一方のVoltageが高すぎたかもしれません。 使用している装置の励起システムが理解しきれていないのですが、もしyellowレーザーでも検出できるように設定変更可能なのであればそちらも検討したいと思います。メーカーに聞いてみます。 50%の漏れ込みは大したことないという理解で正しいでしょうか？ 私の素人考えでは30%程度が限度で、それ以上の漏れ込みは補正しきれなく解析不可かなと普段考えてました。 同時に、片方の漏れ込であれば50%程度でも比較的きれいに補正できますでしょうか？ ＞1. 各検出器の電圧設定(のバランス)を調整する。 ＞2. その前提のもとで、蛍光補正値を設定する。 これは毎回行っております。 ただお話を聞いている限りVoltageがやや高いのかなという気がしてきました。 いつもネガティブ集団が軸に貼り付かない程度にしていますが、それでも高いのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9904-2 - 2021/09/18 (土) 12:45:13 - おもいつかない こんにちは。 PerCP/Cy5.5 と PE/Cy7 との間で蛍光の漏れ込みが大きいのでしょうか。 この2 つだと、一般論としてそこまで重大なもれこみになるかは分かりませんが... もちろん、両方とも blue laser 励起のほうが漏れ込みは大きくなりやすいと思います。 (PE/Cy7 が yellow-green laer 励起のほうが漏れ込みは少なくなりやすい) 分からないので、一般論で申し上げます。 標識 A と B のそれぞれ(あるいはどちらか)の検出器で蛍光のもれこみが大きいとします。そのとき、蛍光補正のとき (A-B) と (B-A) のどちらが補正が大きくなるか、確認してください。 一般に蛍光補正値 (compensation matrix) は 100% 未満になるようにします。なぜかというと、たとえば (A-B) が 120% としますと、Bの標識はBの検出器よりAの検出器でより高い蛍光を生じていることになり、実験以前にFACSの設定がかなりまずいことになります。それでは実際に(A-B)が 100% 達してしまったらどうしたらいいかというと、quick hackとしては以下のいずれか、または両方を行います。 1. Aの検出器の設定電圧(voltage)を下げます。 2. Bの検出器の設定電圧(voltage)を上げます。 これにより、(A-B)の蛍光補正値は確実に下がります。このように、一方から一方へのもれこみだけが問題になる場合は、蛍光補正は難しくありません。 しかし難しいのは、(A-B)と(B-A)の両方の蛍光補正値が高い場合です。その場合は、両方の蛍光補正値がそこそこ(たとえば50%以内)に収まるように調整します。それにより、なんとかデータは取得できます。しかし、二重(双方向) の蛍光補正によってデータの質は確実に低下しますから、肝心要のデータであれば望ましくありません。 ご本人の言にあるように、抗体を希釈してもれこみも下げるというのは、時と場合によってはありえます。しかし、それ以上に重要なのが検出器の電圧設定です。 たけいさんの場合、一点気になるのは、実験の前に compensation beadsを用いて設定しているかどうかです。compensation beads を用いる目的は、重要度順に以下となります。 1. 各検出器の電圧設定(のバランス)を調整する。 2. その前提のもとで、蛍光補正値を設定する。 もし 1 をやらずに 2 のみ行っていると、FACSが実際以上に難しく感じることでしょう。 もしご参考になりましたら幸いです。

flow cytometryマルチカラー染色時の漏れがひどい時の解析方法 削除/引用 No.9904-1 - 2021/09/10 (金) 22:04:23 - たけい いつも勉強させて頂いております。 藁にもすがる思いでお伺いさせてください。 この一年ほどでFlow cytometryのマルチカラー染色を覚えたての者です。 勉強を重ねることで、蛍光補正なしでなるべく解析できるように蛍光色素を組み合わせたり、X-Yで解析する者同士は蛍光色素の漏れのない者同士を組み合わせたり、明るい色素は弱く染めたり、明るい色素は発現量が少ないものを染めたりできるようになりました。 しかし今回の実験では組み合わせが良くなく、補正をかけてもどうしても斜めに尾を引いた集団ができてしまい、high/high集団がどこかわからず非常にがっくりしました。具体的にはX-YにPerCP/Cy5.5-PE/Cy7です。 このような時の応急処置的な解析方法をご教示頂けないでしょうか？Isotype controlは取得しましたので、それとの比較でゲーティングできますでしょうか？それともマルチカラーのため他の色素の影響も乗ってきてそんな安易なものではないでしょうか？ お叱りがあるかもしれませんが、お手柔らかにご教示頂けますと幸いです。 宜しくお願い致します。

全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---