全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1027-10 - 2012/10/22 (月) 17:57:32 - ウェット みなさんご回答ありがとうございます。 実際にやってみたところ、できたようです。 (試したのは私ではないです。。) ただ、2枚あるうちの陰極側のメンブレンに転写の乱れがありました。 なぜかメンブレンの中心３レーンだけです。 メンブレンのすり抜けですが、セミドライで１度だけメンブレンを ２枚重ねて試したことがありますが、２枚目は何も検出されませんでした。 私の場合、タンク式でもCBB染色ゲルを見るとバンドが はっきり確認できるため、まだ転写率が悪くすり抜けを気にする 以前の段階かと考えていますが、みなさんは転写後のゲルは バンドがほとんど見えないような状態になるのでしょうか？？ 泳動マーカーはタンク式では高分子もゲルでほとんど見えなくなるくらい 転写されているので、私も転写効率が高めのように感じています。 カセットって脆いんですね… ミニトランスブロット用は12,000円だったので あんなプラスチックにその値段か！？って思ったんですが、 もっと安いものを知っている方はおられないでしょうか？ スポンジは薄いタイプがもう1セットあるので、とりあえず購入交渉してきます。

(無題) 削除/引用 No.1027-9 - 2012/10/21 (日) 12:34:02 - 774 http://page19.auctions.yahoo.co.jp/jp/auction/x241298879 GEの PhastSystem 全自動電気泳動装置じゃね？と思ったり。 運用費のほうが高く付きそうだが。。。

スポンジだったら 削除/引用 No.1027-8 - 2012/10/21 (日) 09:49:46 - 節約上手 スポンジだけが足りない場合、スコッチブライトの緑色のパッドを代用している人を見かけたことがあります。 問題なく使えていたようでした。 買うとなると数千円しますから、工夫したくもなりますね。

(無題) 削除/引用 No.1027-7 - 2012/10/20 (土) 22:44:17 - (・_・) 購入をためらうほど高額じゃないとおもうで、買ってもらったらどうよ。バラ売りしてくれないとかかそういうことかな。大きな研究室だと古いやつとか使わなくなって沢山放置してたりする事あるから、そういうとこからもらってもいいかもしれない、聞いてみたら。 ていうか、アレ見かけよりも意外とやわくてね、カセットの中身を無理に厚くしてるとプラスチックにひび入ってそのうち割れるよ。

(無題) 削除/引用 No.1027-6 - 2012/10/19 (金) 10:58:39 - toyo 以前のラボでタンク式のウェスタンブロットをルーチンでやっていました。 カセットやタンクの数に限りがある場合には、質問者さんのように、 間に濾紙を追加して、1カセットで2枚のゲルを転写している先輩がいました。 概ね問題なく転写できていたようですが、定量性が大事な実験では念のため 避けていたようです。 着色済み泳動マーカーの転写効率についてですが、以前、転写の高速化を 図って、インビトロジェンかどこかのセミドライ式の転写装置を検討した 際に、泳動マーカーとMagic Markを流したことがありました。 泳動マーカーは綺麗に均一に転写されたのに対し、Magic Markはムラが 多すぎて、実サンプルでは使いものにならないという結果でした。 条件にもよると思いますが、泳動マーカーは転写効率が高くなるように 加工されているのではないかと考えています。

(無題) 削除/引用 No.1027-5 - 2012/10/19 (金) 03:53:14 - おお >[Re:4] cdさんは書きました : > ところで、蛋白がメンブレンをすり抜けるというのは実際に起こりうるものでしょうか?一度、メンブレンを直に二枚重ねて転写したところ、プロテインマーカーの色は確かに二枚目にも移りましたが、ポンソーで染色してもタンパクは二枚目にはみられず、もちろん抗体を反応させての検出も出来ませんでした。すり抜けるのは色素だけ、ってことはないでしょうか?使ったのはPVDFです。 コンディションにもよるのではないでしょうか。PVDFはすり抜けにくいと思います。若干のSDSをたんくのバッファーにいれると吸着性は弱まるとおもいます。ゲルからの溶出効率を上げるために入れる人がいますよね。 たぶんニトロセルロースだったと思うのですが、いっぺんに複数のメンブレンを作るために重ねておくという方法は見たことがあります。メンブレンが特殊なものか、バッファーに工夫があるかどうかなどはよく分かりません。

本当にタンパクはメンブレンをりぬけるのか? 削除/引用 No.1027-4 - 2012/10/19 (金) 03:48:00 - cd 私も ろ紙-ゲル-メンブレン-ろ紙-ゲル-メンブレン-ろ紙 でやってうまくいったことがあります。大丈夫ではないでしょうか? ところで、蛋白がメンブレンをすり抜けるというのは実際に起こりうるものでしょうか?一度、メンブレンを直に二枚重ねて転写したところ、プロテインマーカーの色は確かに二枚目にも移りましたが、ポンソーで染色してもタンパクは二枚目にはみられず、もちろん抗体を反応させての検出も出来ませんでした。すり抜けるのは色素だけ、ってことはないでしょうか?使ったのはPVDFです。

(無題) 削除/引用 No.1027-3 - 2012/10/17 (水) 00:06:13 - ab BioRadではないウェット式を使ってますが、ゲルとゲルの間に厚めのろ紙を挟んでやってます。 ブロッティングの時間や電圧が関係すると思うのですが、特に転写ムラやコンタミなどの問題はありません。 3枚まで重ねてやったこともあります。 コンタミを気にするなら、セロファンや透析膜を挟んで防止する方法もあるようです。 あと、以前1枚のゲルから10枚のメンブレンにトランスファーするシステムが売られてましたが、今でもあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1027-2 - 2012/10/16 (火) 22:03:41 - kodamataro 一応できました。 ただし、メンブレンを直に2枚重ねて着色マーカーで転写するとわかるのですが、蛋白がメンブレンをすり抜けて、2枚目のバンドにも転写されてしまうことがあります。 そういうことを考えれば、カセットを使って少しでも距離を離してあげることは多少なりとも意味があるのかなと思います。

タンク式のウェスタンブロット 削除/引用 No.1027-1 - 2012/10/16 (火) 18:54:58 - ウェット タンク式のウェスタンブロッティングについて質問です。 転写効率を上げるため、最近タンク式を使い始めたのですが、 研究室にはゲルを挟むカセットが1つしかありません。 2枚同時に転写するためにFiber Pad を使わず、 ろ紙-ゲル-メンブレン-ろ紙-ゲル-メンブレン-ろ紙 と、カセットに挟んで転写することを考えたのですが、 やっぱりうまく転写されないものでしょうか？ Fiber padはゲルとメンブレンを密着させるためのクッション材の ためだけに入れていると思ってるのですが違うのでしょうか？ 密着度が下がれば転写ムラが起こるなど問題があると思うので、 一応余裕のあるときに試してみようとは思っています。 Bio-radのミニトランスブロットを使っています。

全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---