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PCR酵素の活性温度について 削除/引用 No.10317-7 - 2023/01/31 (火) 18:14:08 - coffee すみません、疑問に思ったことがありましたので、こちらで質問させていただきます。 PCR用のKOD等のα型の酵素ですが、60-68℃付近で酵素活性の最大を示してヌクレオチドを伸長させますが、同時に、3'⇒5'のエキソヌクレアーゼ活性も示すと思います。 この3'⇒5'のエキソヌクレアーゼ活性も同じ温度帯で最大活性を示すと考えてよいでしょうか？ それとも、最大活性温度が異なるということはあり得るでしょうか？ どうぞよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.10317-6 - 2022/03/09 (水) 13:37:56 - yuuu T-2さま　 ご返信ありがとうございます。 DTTについては、酵素はまだ購入したばかりで未使用でしたので、ヘタってはないと思っております。 電気泳動して確認してみます。 SYBR masterさま 論文の提示ありがとうございました。 random primerがthiol-bondすることでプライマーが消化されないのですね。 自分の中での疑問が解決しました。大変助かりました。 皆様ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.10317-5 - 2022/03/07 (月) 14:11:57 - SYBR master このキットの元論文です。 Rapid Amplification of Plasmid and Phage DNA Using Phi29 DNA Polymerase and Multiply-Primed Rolling Circle Amplification https://genome.cshlp.org/content/11/6/1095.short Phi29 DNA polymeraseはexo活性が非常に強いので、random primerの３末2塩基をthiol-bondにしてexo活性を阻害しています。このthiol-bondのため、新鮮なDTTは必須です。現在市販されているキットのprimerおよび酵素濃度は販売開始から、少し下げられたはずですが、基本組成は同じです。 このキットは基本templateが無くても増幅産物(template independent amplification)が起こります。現在の所、酵素由来のDNAが一番の原因と考えられています。この論文以降に、国内からも論文出ていますので、ご確認しご参考にしてください。 増幅が上手くいっているかどうかは、適切な制限酵素で切断して目的plasmidと同じサイズであるかどうか確認してください。

(無題) 削除/引用 No.10317-4 - 2022/03/07 (月) 09:02:22 - T-2 使用されている酵素のメーカー、バッファーの組成を示されたらどうでしょうか。 反応には還元剤が必須のようですが、DTTがヘタっている可能性はありませんか。 phi29による反応後、一部を電気泳動すれば反応が進行しているかはわかるはずですが。

(無題) 削除/引用 No.10317-3 - 2022/03/06 (日) 14:00:25 - yuuu Hiro さん ご返信ありがとうございます。 templiphiキットを使用した増幅は確認してますが、個別に用意した試薬での増幅は確認していません。サンガーシーケンスで波形が出てないので、反応自体うまく行ってないと思われます。

(無題) 削除/引用 No.10317-2 - 2022/03/06 (日) 08:59:20 - Hiro 反応自体が起こっているのは確認したのでしょうか？

鎖置換型酵素であるphi29による増幅について 削除/引用 No.10317-1 - 2022/03/04 (金) 13:34:25 - yuuu 掲題の内容についてご相談があります。 鎖置換型酵素であるphi29は、全ゲノム増幅などに使われる酵素だと思いますが、サンガーシーケンスを行う為のプラスミド増幅にも使用されているかと思います(GE healthcare：templiphi kit) templiphi kitを使用した場合、プラスミドを増幅させて良好なシーケンスデータを得ることができるのは検証済みなのですが、このキットを使用せず自前で個別に試薬を用意し、調整できればと考えております。 templiphi kitのマニュアルによると、必要となる試薬は「phi29/phi29 buffer/random prime(6mer)r/dNTP」のようで、templiphi kitのマニュアルを参考にして下記の手順にて調整しました。 �@精製済みプラスミドにrandomprimerと滅菌水を混合し、95℃で3minヒートショック→4℃急冷 �U上記溶液にdNTP、phi29buffer、phi29を混合し、30℃で18時間→65℃で10min(酵素失活処理) �V得られた溶液から1.5μl程度使用してシーケンス反応の鋳型とする なお、上記で使用した試薬の量(終濃度)は下記のとおりです。 ・精製済みプラスミド(1ng/μl)・・・1μl ・random primer・・・終濃度0.5μM ・dNTP・・・終濃度200μM each ・phi29 buffer・・・1μl ・phi29 ・・・0.1μl(1U) ・滅菌水・・・全量が10μlになるようにfill up 何度か上記の試薬と手順にて増幅を試みたのですが、サンガーシーケンスに持ち込んでも全く波形が得られず困っています。 もし上記の手順で怪しい点がありましたら、わかる方がいらっしゃればどなたかご指摘いただけるでしょうか。 長文失礼しました。

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