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(無題) 削除/引用 No.10973-24 - 2022/11/29 (火) 12:19:10 - おお よくわからんのだけど合成ペプチドで抗原性を予測するツールはヘリックスやベーターシートのような構造を持つところを除外して、外側に露出しているランダムコイルのような構造を持たない場所を抽出してくるのではなかったっけ？それで高次構造の認識できる抗体ができるというのはよくわからないなぁ。経験上でできたのならそれを否定するつもりはないんだけど。

(無題) 削除/引用 No.10973-23 - 2022/11/28 (月) 13:40:59 - G25 高次構造認識抗体は必ずしもMabじゃないと取得できないということもないと思います（ないはず）。 過去に一度だけそういう経験があるのですが、 あるタンパク質のウサギ抗血清を作ろうとしていて、なかなか抗体価が上がらず、かなり長期間（1年近かったかも）しつこく免疫していました。 抗体の出来具合をチェックするプロトコールの一環で、western blotをやっていたのですが、全然、ずっとそれらしいバンドが出なかったので、なかば諦めていました。しかし、あるとき思い立って、いきなり組織染色してみたらちゃんと染まったのです。その後、その抗体（抗血清）はかなり活躍しました。 >そうするとそういう抗体を入手するにはハイブリドーマを作成し、そこから粘り強く、ハイブリドーマの1個1個を組織免染でスクリーニングしていくしかないでしょうか 詳しいことは知りませんが、 まず、非変性タンパク質でポジティブを選び、その中から変性タンパク質にもポジティブなものを外すというようなストラテジーをとるようです。 https://www.cytivalifesciences.co.jp/newsletter/biodirect_mail/technical_tips/tips63.html 非変性タンパク質でのアッセイは必ずしもIHCでなくてもいいと思います。 発現組織・細胞の非変性条件のライセート、モホジネートなど、あるいはそれこそ今やられているように哺乳類細胞で発現させてある程度精製濃縮したタンパク質なんかELISAに丁度いいんじゃないですか。

(無題) 削除/引用 No.10973-22 - 2022/11/28 (月) 07:49:17 - sample ありがとうございます。 作成したい抗体は組織免染で使用できる抗体となります。 タンパク質の高次構造を認識する抗体やグリコシルなどの翻訳後修飾を認識する抗体はT細胞非依存性であるとの記述はたしかにネッド状でちらほら見受けられました。　 そうするとそういう抗体を入手するにはハイブリドーマを作成し、そこから粘り強く、ハイブリドーマの1個1個を組織免染でスクリーニングしていくしかないでしょうか。 また抗原として使用するリコンビナントタンパク質も全長ではなくとも、ペプチドを合成し、そこに翻訳後修飾（リン酸化やごグリコシル化）をコンジュゲーションすることで抗原性の高い免疫元が得られる可能性もあるということでしょうかね。

ネイティブのタンパク質を認識出来る抗体ということであれば 削除/引用 No.10973-21 - 2022/11/26 (土) 09:32:41 - ああ ELISAや免沈など非変性条件でタンパクを認識する抗体が欲しい、というのであれば、単に血清からの精製時にだけ、ネイティブ発現系のタンパク質を使うのがよろしいかと思われます。そんなに量がいらないですし。 抗体を作る過程は、外部に晒されていると予測される(してもらう)、合成ペプチドのミクスチャーをキャリアに繋げてもらえば、十分かと。 糖鎖を含んだ認識が必要であれば、そこまで長いものでなければ、合成してペプチドに結合できたような気がするがどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10973-20 - 2022/11/25 (金) 18:59:34 - zam 立体構造云々の話は、トピ主さんが >[Re:9] sampleさんは書きました : > 哺乳類細胞を使用しているのは翻訳後修飾があるため、立体構造のままタンパクを免疫できるので、より精度の高い抗体が取れるかもしれないと考えたからです に端を発していますが、もしそれが「高次構造を認識する」抗体という意味であるならば、必ずしもそうとも言い切れないと思います。違っていたらご容赦ください。 トピ主さんがモノクローナル抗体とポリクローナル抗体のどちらを取ろうとしているのかわかりませんが、立体構造云々ということであれば、おそらくモノクローナル抗体を前提としていると思いましたので、その線で書きます。こちらも違っていたらご容赦ください。 モノクローナ抗体を自作し、自分でスクリーニングした方であれば経験的に知っておられると思いますが、ドットブロットやWBには反応が弱いのにELISAでは強く反応する抗体が取れることがあります。要因は様々考えられますが、抗原の変性状態の違いを認識している可能性も一つ考えられます。 さらに、大腸菌で作ったリコンビナントタンパク質を免疫したときにも、さらには、ペプチド抗原を免疫したときにも、このような事が起こることがあります。そもそも動物に免疫するときは、抗原はたいていは変性状態にあります。 私が申し上げたいことは、動物細胞で完全長のタンパク質を発現させなくても、「高次構造を認識する」モノクローナル抗体が取れる可能性があり、逆に動物細胞で完全長のタンパク質を発現させたからといって、「高次構造を認識するモノクローナル抗体」が必ずしも取れるとは限らない。結局はやってみなければ分からない、ということです。 後々の実験を考えると、動物細胞による完全長タンパク質の発現系を用意しておいて損はありません。少なくともモノクローナル抗体のスクリーニングの際に、あってよかったと思うはずです。 ただ、免疫原のことだけで言えば、「立体構造を認識する」モノクローナル抗体の取得も視野に入れているとしても、必ずしも動物細胞による完全長リコンビナントタンパクにこだわらなくてもよいということです。

(無題) 削除/引用 No.10973-19 - 2022/11/25 (金) 18:58:33 - zam IgG抗体（T細胞依存性）でも3次元的エピトープ（不連続エピトープ）を認識する抗体は、あることはあります。ただし直線的エピトープ（連続エピトープ）を認識する抗体に比べて少ないです。 高次構造を認識する抗体が少ないのは、生成メカニズムとしてできにくいことと、そもそもエピトープまで解析する事例が少ないことが考えられます。 不連続エピトープが生じるメカニズムは、私は知りません。 コメントにもある通り、通常は、ウイルス感染や貪食によって細胞内に取り込まれた抗原タンパク質がプロテアソームによって分解され、MHCポケットにハマり、細胞表面に提示され、T細胞に認識され、細胞媒介免疫へと進むわけですが、この過程で1本のペプチド断片がMHCポケットにハマりやすいと思われます。しかし不連続な複数のペプチド断片が提示されることも稀にあるのかもしれません。 多くの研究者は実験で抗体を使えればよく、エピトープ解析までする人は少ないでしょう。したがって、連続エピトープと不連続エピトープの比率を網羅的に調べた研究はないかあっても少ない。 たまたま抗原の変性状態によって反応が異なるモノクローナル抗体が取れて、それを「立体構造を認識する」抗体としているのがが現状だろうと思います。 ですから、不連続エピトープの抗体は非常に少ないようですが、それは生理的な存在比率を反映したものかどうかはわかりませんし、ひょっとしたら生理的には不連続エピトープに対する抗体が、もう少し多くできているのかもしれません。 ただの推測です。

(無題) 削除/引用 No.10973-18 - 2022/11/25 (金) 15:07:38 - G25 >こちらに関して、記述ある論文あれば、教えていただけますでしょうか。 なにかの教科書かガイドブックで読んでそのように理解したのだと思いますが、なんだったかかちょっと見つかりません。T細胞非依存性抗原やT細胞非依存的抗体産生について調べるとヒントにはなるでしょう。 ただ、 ・通常の抗体作成はT細胞依存的抗体産生であって、つまり貪食細胞によって消化され提示された10 aa前後(教科書的には8 aaとも言われる）のペプチドが抗原になる。 ・もしタンパク質の高次構造を認識する抗体ができるとしたら、T細胞非依存性あり、T細胞依存的抗体産生のような二次応答による劇的なブーストは起こらない（そしてそういう抗体は多くの場合IgMである）。 という知識に照らすと、 高次構造を保ったタンパク質を使うと良い抗体ができるとか、高次構造を認識する抗体ができるという主張は疑問ですし、 ブースト無しで十分なタイターの抗体を得るのは短期間では無理だろうというのは想像に難くないと思います。 私自身、そのへんの知識はぼんやりしているので、エキスパートの添削がほしいところです。

(無題) 削除/引用 No.10973-17 - 2022/11/24 (木) 22:59:57 - sample みなさんありがとうございます。 IPでは逆に共沈降される蛋白が多いことは想定しませんでした。そうすると哺乳類細胞で発現して免疫沈降の方が、大腸菌で発現して金属カラムで精製した蛋白より純度低くなる可能性も十分にありそうですね。 また抗原ペプチドを合成して抗原とする場合と目的タンパク質の立体構造的にドメインに分けて、トランケートをいくつか大腸菌で作成して、タンパク抗原をカラムで精製する場合をみなさんより提案していただいたが、後者の方がより長い抗原作れるので、より精度の高い抗体を作成できる可能性が高いという考えでよろしいでしょうか？ G25さん 「高次構造とか糖鎖とかを見る抗体はT細胞非依存的でB細胞が直接抗原に触ってできるけれど、T細胞依存性とちがって二次応答でタイターが急激にあがるのではなく、長い期間かかってじわじわ上がってくるものではなかったか。」 こちらに関して、記述ある論文あれば、教えていただけますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10973-16 - 2022/11/24 (木) 08:44:02 - １ 費用や実験の労力を考えた時、リコンビナント発現してIPで精製という方法よりも、抗原ペプチドを合成してキャリアタンパク質にコンジュゲートしたものを免疫原とする方が得策と思いますし、抗体作成では、今はこの方が一般的です。抗原性の高い部位のペプチド配列の予測、合成、コンジュゲートは外注でできます。必要ならば免疫〜抗体価評価も外注できます。いろんな会社でやっていますので、一度調べて見てください。 どうしてもリコンビナントでという場合、モノクローナル抗体でよければ、ラット腸骨リンパ節法という確立された方法があります。抗原1mg程度を１回注射します。

(無題) 削除/引用 No.10973-15 - 2022/11/23 (水) 08:11:45 - 独り言 立体構造を保った抗原で抗体を作る必要性がどこまであるのかによりますが、培養細胞からFLAGで精製して抗原を５ｍｇも回収するのはかなり現実的ではないように思えます。少なくとも培養細胞で超高発現できるタンパク質であればともかく。 他の方もコメントされているととおり、ＦＬＡＧ抗体による精製だけではノンスぺもありそうだし。それなりのコストもかかるでしょう。 だったら、立体構造的にドメインに分けて、5種類とか多めにトランケートをいくつか大腸菌で作成して、抗原の数で勝負するほうが、労力はかなり少なくてすむかと。 最近はウサギ抗体作成は、5−10万円程度で外注できるから、気軽にたのみやすいですよね。

(無題) 削除/引用 No.10973-14 - 2022/11/23 (水) 07:16:24 - おお 指摘があるようにIPなど生理的に近い溶液の条件では共沈するものが気になります。 何種類のクロマトなどを使うとかして精製度を上げたほうがいいように思います。硫安沈殿とかでそのタンパクが変性しないならコンプレックスを壊すこともできるでしょうし、沈殿して構造が変わりそうなら、ある程度の硫安でターゲットが沈殿しない濃度で処理して、夾雑物をいくらか除いて疎水クロマトにかけるとか。疎水クロマトも吸着して取れなくなる場合もあるのでそれなら、吸着しないぐらいの塩濃度で夾雑物をいくらかでも吸着させるてもあるし。 イオン交換でも物によっては高い塩濃度で溶出されることもあるのでそういう操作でもコンプレックスが解離していくきっかけにもなります。 そんなことをあれこれ方法論として考えながら思うのは、例えば動物組織などから回収して生化学的手法を色々使って精製したほうがいいような気がしてきます。牛とかは臓器がでかいし昔はよくタンパク精製などで使われていたはずです。

(無題) 削除/引用 No.10973-13 - 2022/11/22 (火) 20:47:52 - G25 あとこれは私の思い込みで、分野や扱う材料によってはそんなん普通ですよと言われることかもしれないけど、 できた抗体は哺乳類のサンプルに使用するのだと見ましたが、、、 哺乳類細胞で発現させたタンパク質は内在性のタンパク質が夾雑する可能性が高く、それに対する抗体もできてきますね。抗原の精製、抗体のアフィニティ精製あるいは前吸収をよほど頑張らないと、標的タンパク質以外の内在性タンパク質に反応する抗体を排除するのは難しいのでは？　結果、バックグラウンドの高い抗体になってしまう危惧があります。モノクロでもたてるのならべつですけど。 nativeなコンフォメーションや活性、相互作用を保ったタンパク質を発現させて手に入れたいというのなら由来動物に近い細胞株で発現さようというのは頷けますが、抗体を作るための抗原として使おうというときにはgood ideaではないように思います

(無題) 削除/引用 No.10973-11 - 2022/11/22 (火) 14:40:04 - G25 免疫は付け焼き刃なので、間違っていたら詳しい人が訂正してください。 >立体構造のままタンパクを免疫できるので、 通常の抗体作成はT細胞依存的抗体産生であって、つまり貪食細胞によって消化され提示された10 aa前後のペプチドが抗原になるので、タンパク質の高次構造は見ないんじゃなかろうか(ペプチド分子上の立体構造はさておき）。いかにnativeなタンパク質であろうとも、抗原となるときは断片化され立体構造なんか関係なくなるし、変性タンパク質であろうとも断片になってしまえば提示抗原としては変わらないんじゃなかろうか。 高次構造とか糖鎖とかを見る抗体はT細胞非依存的でB細胞が直接抗原に触ってできるけれど、T細胞依存性とちがって二次応答でタイターが急激にあがるのではなく、長い期間かかってじわじわ上がってくるものではなかったか。 いえね、nativeなタンパク質を抗原にするのはそれなりにメリットが期待できるのかもしれませんけど、たとえそれがあったとしても費用や労力に見合うものかと、

(無題) 削除/引用 No.10973-10 - 2022/11/22 (火) 13:48:52 - おお >[Re:9] sampleさんは書きました : > > > タンパクの溶出はdynabeads epoxyにFLAG抗体つけて、溶出を低pH法でやっております。 > 低ｐH法でもビーズ抗体結合を壊せずにビーズ抗体複合体を再利用できますか？ 基本、出来ます。ビ-ズとの結合はコバレントなので剥がせません。ただ、極端な条件で抗原を剥がすので、抗体はちょっとずつへたってくる可能性はあります。低いpHのほかに、高いp Hや比較的マイルドなカオトロピックイオン(リチウムイオン数Mとか、3.5MぐらいのMgC l2など)も抗体のダメージを極力抑えて抗原を外す試薬として使われることがあるようです。

(無題) 削除/引用 No.10973-9 - 2022/11/22 (火) 13:02:44 - sample みなさんありがとうございます。 浮遊系の293Tで過剰発現すれば、1週間でとれることもあるですね たしかに今の細胞株は発現量は多くないです。CRISPR/Cas9でAAVS1 siteへ１本のみ変異入っていますので。プロモーターはＣＭＶです。またなんらかのサイレンサーによってさらに発現が減っている可能性も否定できません、 哺乳類細胞を使用しているのは翻訳後修飾があるため、立体構造のままタンパクを免疫できるので、より精度の高い抗体が取れるかもしれないと考えたからです 免疫原5 mgは、抗体のアフィニティー精製に使う分も込みです。 タンパクの溶出はdynabeads epoxyにFLAG抗体つけて、溶出を低pH法でやっております。 低ｐH法でもビーズ抗体結合を壊せずにビーズ抗体複合体を再利用できますか？それでも3�IFLAGのペプチドによる競合溶出でないと再利用できないでしょうか？ また抗体再利用しても5�rがなかなか取れないであれば、他の方おっしゃる通りに大腸菌による金属カラムでの回収の方が現実的かもしれません。またDNA免疫やmRNA免疫も可能ですね。検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.10973-8 - 2022/11/22 (火) 10:52:57 - おお あ、抗体って書いてるの見逃していた。 なにか特殊な事情があって哺乳類細胞を使っているのでしょうか。ないなら発現系を見直したほうがいいかと。大腸菌で作ってしまうことも多いかと。 通常のIPでは相互作用する色々なものが混じってくるよ。

(無題) 削除/引用 No.10973-7 - 2022/11/22 (火) 10:10:11 - G25 抗体作成の免疫原に使うくらいの目的でFLAG抗体のアフィニティー精製はもったいない。FLAG抗体やそのカラムは高価だし、免疫原にするのにそれほど攻めた精製度は必要ないと思います。His tagとかGSTとかのほうが費用対キャパシティーが稼げる。 免疫原タンパク質を5 mgも要求されるとは免疫動物はウサギでしょうか（まさかヤギとかヒツジとか？）。教科書的にはone shot量がマウスで5-50 ug、ウサギでその50-200 ugくらいでしょうか。doseを加減すれば5 mgより節約できるかもしれないですが数十ugではone shot分にしかならないですね。現実的じゃないですね。 あ、それとも免疫原5 mgは、抗体のアフィニティー精製に使う分も込なのかな。

(無題) 削除/引用 No.10973-6 - 2022/11/21 (月) 22:45:07 - zam 誤　肯定 正　抗体 失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.10973-5 - 2022/11/21 (月) 22:44:02 - zam 5mg必要というのは受託屋の言葉でしょうか？ 受託屋からすれば5mgは欲しいところですが、5mgなくても免疫が着くこともあります。成否は必ずしも量に依存しません。5mgあっても肯定が取れないこともあります。ですのでそこは交渉次第です。 （もちろん、抗体が取れなかったときには、タンパク量が少なかったせいにされるかもしれませんが） あるいは、タンパク質による免疫ではなく、DNA免疫やmRNA免疫もご検討ください。 ただし抗体評価やスクリーニングを考えると一定量のタンパク質は必要になります。必要量はスクリーニング方法や評価方法に依存します。 どうしても5mgのタンパク質が必要な場合には、他の方々もコメントしているように、アフィニティー精製がよろしいと思います。溶出は競合法、キレート法、低pH法、プロテアーゼ法などがあります。 免沈でなければならない場合には、既にコメントにあるように、抗体レジンの再利用がよいでしょう。こちらも溶出は競合法のほかに低pH法もあります。

(無題) 削除/引用 No.10973-4 - 2022/11/21 (月) 22:07:24 - qq 5mgのタンパク質って、かなりの量ですよ？ 付着性の細胞であれば、10-cm dish1枚に5mgくらいの全蛋白があるんじゃないだろうか？その中の何％が発現したタンパクだとかんがえましょうか？ そう考えると、発現した蛋白が5mgあるような抽出液だとか、IPの効率がどのくらいだろうとか、想像することもできるのではないかと思います。 大腸菌、酵母やバキュロを使う方法も考える必要があるんじゃなかろうか？

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