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(無題) 削除/引用 No.1479-16 - 2013/03/31 (日) 18:45:46 - あ 日本ジェネティクスのキットがオススメです。 http://www.n-genetics.com/product_detail.html?item_id=4480

(無題) 削除/引用 No.1479-15 - 2013/02/24 (日) 21:12:33 - びん 皆様、どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1479-14 - 2013/02/24 (日) 20:19:36 - KEN TAKARA経由で購入するならば、 V5910　MiraCLEAN® Endotoxin Removal Kit 10 mg DNA用 ￥27,000 ですね。 特にキャンペーンしているわけではないので、もっと安いところがあればそちらを推薦します。 だいたいは、使わなくても大丈夫だと思います。 また、通常のプラスミド精製カラムは、メーカーにサンプルを頼めばたいてい数個はもらえます。色んなメーカーにもらえば、まあ、ちょっとした実験には事足りるかとも思ったりします。

(無題) 削除/引用 No.1479-13 - 2013/02/24 (日) 19:52:29 - びん 皆様、重ねての御助言をありがとうございます。 おかげさまで、当方の知識をアップデートできました。 ちょうどタカラがキャンペーン中なので、次を買おうと思います。 　タカラ　U0615A　NucleoSpin® Plasmid QuickPure 50回 ￥6,300 当方の目的は、エンドトキシンが少しぐらい残っていても大丈夫だと考えられますので、これを、トランスフェクションにも用いてみます。 KENさん、すみませんが、もうひとつ教えてください。 NucleoSpin® Plasmid QuickPure で精製したプラスミドをエンドトキシンフリーにした方が良いという事態になった時のために、御推薦のエンドトキシン除去カラムのメーカーと品番を教えてください。

(無題) 削除/引用 No.1479-12 - 2013/02/24 (日) 15:32:26 - ん miniprep kitで検索すればたくさん出てきます。キアゲンでなくても大丈夫です。念のため。

(無題) 削除/引用 No.1479-11 - 2013/02/24 (日) 15:30:22 - ん フェノールを使わず、カラムで精製するものですが、QIAprep Spin Miniprep Kitで調整したプラスミドで、２９３にトランスフェクションして発現できます。エンドトキシン混入を可能な限り除きたい場合、例えばLPS等に対する細胞の応答を見るような実験には、エンドトキシンフリーにするグレードの高いキットを買う必要があると思います。フェノールを使うとそのままではトランスフェクションは厳しいと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.1479-10 - 2013/02/24 (日) 15:03:29 - KEN 最初から混ざっているWAKOの 311-90151 250ml 15,000 で良いんじゃないですかね。 個別に買っていたら、おそらく、定年までに使い切らずに終わる予感が。。。 あと、私も最近は、カラム精製しかやっていませんね。 楽ですし、早いですし。 エンドトキシンフリーとなると、値段は少しあがってしまいますが。。。 当方は、TAKARAが安くなるときに購入しています。 少量ならば、先に、普通のカラムで精製して、後からエンドトキシン除去カラムで精製した方が安いかもしれません。 www.takara-bio.co.jp/goods/catalog/pdf/macherey_plasmiddna.pdf

(無題) 削除/引用 No.1479-9 - 2013/02/24 (日) 15:03:17 - AP > TE飽和フェノールではなくフェノクロを使いたい理由は、うろ覚えですが、除タンパク効果がフェノクロの方が良かったという事です。 市販品でもバッファー飽和PCIはありますけれどね。 それと、もちろんPCIあるいはフェノールクロロフォルムを作るときのフェノールも予めバッファー飽和させておく必要があります。TEの場合もありますが、0.1 M程度のTrisバッファーを使うのも一般的です。念のため付け加えると、フェノールのpHを中性付近（pH 8.0)にするため、3回ほどバッファーを交換しながら飽和させます。その際、0.5-1 M程度のTrisバッファーで行い、最後に保存用のバッファー（TEや0.1 M Trisなど）に交換します。 > それから、TE飽和フェノールの後のクロロフォルム抽出をスキップできるという事ですが、両方が混じっているフェノクロを使うと、ステップ数が減らせるから、と記憶しています。 古典的には、フェノール→フェノールクロロフォルム→クロロフォルムと3段階の抽出をするのが常法でした。しかし、除タンパク質だけなら、フェノールクロロフォルム抽出だけでも効果は十分であり、フェノール単独より水層との分離が良いことから、フェノールクロロフォルム抽出だけでやるのが一般的になりました。 多糖類、例えばアガロースを除く目的では、フェノール単独で抽出したほうが効果が高いので、そういう目的ではフェノール単独で抽出する意義は残っています。 >イソアミを入れない場合も、フェノ：クロは25:24ですね？それから８‐キノリノールを入れる量は、どの程度の割合までケチれるでしょうか？ もともとはフェノール：クロロフォルム1:1です（ただし、バッファー飽和フェノールの体積に対して。クロロフォルムを加えるとフェノールが水を吐き出して体積が減ることに注意）。25:24:1という比率は、クロロフォルム抽出用に、クロロフォルムイソアミルアルコール24:1が常備されているのが普通であったころ、フェノールに混ぜるのにもそれを使ったなごりです。 8-HQはフェノール単体に対して0.1 %（w/vまたはw/w)が普通ですね。まず、単品のフェノールに必要量の8-HQを加えてから、バッファー飽和の操作をすればいいですね（バッファーを加えると、フェノールの体積も重量も変わってしまいます）。また、8-HQに加えて2-MEを加える調製方法・製品もあります（私は採用していません）。

(無題) 削除/引用 No.1479-8 - 2013/02/24 (日) 14:10:43 - びん 少々、補足です。 TE飽和フェノールではなくフェノクロを使いたい理由は、うろ覚えですが、除タンパク効果がフェノクロの方が良かったという事です。 それから、TE飽和フェノールの後のクロロフォルム抽出をスキップできるという事ですが、両方が混じっているフェノクロを使うと、ステップ数が減らせるから、と記憶しています。

(無題) 削除/引用 No.1479-7 - 2013/02/24 (日) 14:10:04 - qp プラスミドを作る、大腸菌から抽出する、細胞へのトランスフェクションに使用する いずれもやっていますが、私はフェノクロをルーチンで使う必要は全く感じません。 今日び、細胞に導入するレベルで安心のDNAを用意するにはkitを使ってやることが多いですし （LPSの問題とか考えると）、フェノクロを自作するにために別個で買うと、それらを使い切るために数年かかるのではないかと思うほどの量を買うことになるしで、私は小さな調整済みの小瓶を替えば十分です。 20年ぶりにプラスミドを使うことになったということで、 その辺の知識が２０年前なので、何も考えずにフェノクロが必要と思っているのなら、 目的は細胞に導入である、そのために必要な試薬、クオリティーを考えてから 本当にフェノクロを準備する必要があるのか？と考えた方がいいのでは？ と、よけいなおせっかいでした。

(無題) 削除/引用 No.1479-6 - 2013/02/24 (日) 13:53:05 - びん 早速の御回答に感謝します。 APさん。求めていた回答ずばりです。ありがとうございます。念のために確認させてください。イソアミを入れない場合も、フェノ：クロは25:24ですね？それから８‐キノリノールを入れる量は、どの程度の割合までケチれるでしょうか？ ============= んさん。QIAprep Spin Miniprep Kit (50)は次の商品ですね？ http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Sample-Technologies/DNA-Sample-Technologies/Plasmid-DNA/QIAprep-Spin-Miniprep-Kit#productdetails 確かに50個で11000円というのは、目的の数次第では良い選択だと思います。大腸菌へのトランスフォーメーションには使えるという記載は上記のウェブで確認できました。ほ乳動物細胞へのトランスフェクションにも使えるという記載はウェブには無いですが、んさんのこれまでの御経験で、エンドトキシン混入の問題が無かったという事ですね？当方ではHEK293細胞へのトランスフェクションを最終目的にしているので、もし使用可能ならば大変に有り難いです。

(無題) 削除/引用 No.1479-5 - 2013/02/24 (日) 12:51:06 - AP 早いことは早いけれどコストが10倍くらいします。 ルーチンに使うには、簡単な試薬なのに馬鹿らしいくらい高い。

(無題) 削除/引用 No.1479-4 - 2013/02/24 (日) 12:26:45 - qp 調整済みのフェノクロ溶液買った方が早いんじゃ？

(無題) 削除/引用 No.1479-3 - 2013/02/24 (日) 09:43:27 - AP > （１）おぼろげですが、２０年前にはフェノもクロホも和光の特級クラスを使っていたと記憶しています。分子生物学用とか核酸抽出用とかでなくても大丈夫ですよね？ 大丈夫です。20年以上にわたり、特級クラスのしか使っていませんが問題ないです。大昔は、試薬フェノールの品質が悪く、再蒸留したりして使っていたそうですが、今はそんな必要もないです。 > （２）一番、必要量の少ないイソアミの100ml程度の小容量で、値段の安い商品を販売している会社はないでしょうか？和光などのウェブを見ると、500mlなどしか無く値段が高いので、当方の量では、自作メリットがあまり無いです。 フェノールクロロフォルム抽出を目的にするだけならイソアミルアルコールは必要ありません。イソアミルアルコールの添加はクロロフォルム抽出をやりやすくするためですが（たとえば、水層がクロロフォルム層に囲まれた球状になるのを防ぐ）、フェノールクロロフォルムの場合はその必要はありません。また、エタノール沈殿でフェノールは除去できるので、フェノール除去を目的としたクロロフォルム抽出はスキップしてかまいません。 > （３）８‐キノリノールは確か黄色い色をつける目的でしたっけ？添加しなくても大丈夫ですよね？ 8-HQは酸化防止剤、ラジカルスカベンジャーです。フェノールの酸化により核酸にラジカル反応を起こす可能性があるので、入れるべきです。

(無題) 削除/引用 No.1479-2 - 2013/02/24 (日) 09:35:34 - ん フェノール試薬ではないですが、QIAprep Spin Miniprep Kit (50)を買われてはどうでしょうか。 そのままシーケンスやトランスフェクションに使えます。

フェノ：クロホ：イソアミ25:24:1を安く作る方法 削除/引用 No.1479-1 - 2013/02/24 (日) 08:28:39 - びん お世話になります。 ２０年ぶりに、プラスミドを作る必要になったおじさんです。 TE（pH8.0）飽和フェノールや、フェノ：クロホ：イソアミ25:24:1(以下、PCI)を自作しようとしています。PCRで目的cDNAを増幅して、制限酵素切断して、リガーゼでつなぎ、大腸菌でそのプラスミドを増やして、アルカリ法でプレップして、シーケンスするまでの過程のためです。以下の質問について皆様の御意見をお願いし増す。 （１）おぼろげですが、２０年前にはフェノもクロホも和光の特級クラスを使っていたと記憶しています。分子生物学用とか核酸抽出用とかでなくても大丈夫ですよね？ （２）一番、必要量の少ないイソアミの100ml程度の小容量で、値段の安い商品を販売している会社はないでしょうか？和光などのウェブを見ると、500mlなどしか無く値段が高いので、当方の量では、自作メリットがあまり無いです。 （３）８‐キノリノールは確か黄色い色をつける目的でしたっけ？添加しなくても大丈夫ですよね？

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