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(無題) 削除/引用 No.1549-4 - 2013/03/19 (火) 05:45:07 - U2 その昔、コラボレーション先から、「high titerのウイルスが取れない」と苦情があり、ウイルス上清を送ってもらって調べてみたら10の7乗のhigh titerだった、という経験があります。よくよく聞いてみると、タイター測定用の3T3細胞に感染後O/NでFACSにかけていたようで、感染後48時間で測定してもらうようにしたらまったく問題がなくなりました。その時はレトロウイルスでしたが、レンチでもO/Nはちょっと短いと思います。 GFP発現レンチウイルスで293Tに感染するとライセートが黄緑に光って見える事はよくあります。ある程度のタイターのウイルスが取れている証拠だと思います。最初の方の２回目がそのような結果だったならば、ウイルス溶液そのものは問題ないという事になりますね。このレベルだと、蛍光顕微鏡のqualityはまったく問題になりません。 感染する時の細胞数を減らすと、MOIが上がって感染効率が良くなったり、multicopyで感染してGFPのintensityが上がったりします。最初の方の１回目と２回目でまいた細胞数がかなり違ったりしませんでしょうか。 普通にウイルスの系が走っているラボであれば、コンスタントに１０の６乗から７乗のタイターが出ていると思うので、タイトレーションは不要という意見も一理あると思います。実験がうまく行っていれば特に問題ないのですけどね。 こんなところです。ご参考になれば、幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1549-3 - 2013/03/19 (火) 04:37:25 - おお ありがとうございました。GFP観察時の検出かんどは倒立蛍光顕微鏡の最低レベルの機種を使ってますし、光源も強くないものを使っています。 2回目のやつは可也光っていて、そのまま増やして(セレクションなしで)ライセートを取るとライセートが明らかに緑色になるほど発現しています。 3回目の私がやったものはO/Nで見えなかったのですが24時間ごボヤー見れるかぐらいだったので、必要処理をしながらその翌日みると全体的には弱いですけど70%ぐらいは光っていたので、初回なにか変なことが起こってたのかといま考えています。続けて様子を見ていきたいと思います。 タイターは実験で提供してくれる所でははかってないようで、はかる、必要ないの押し問答であまり生産性のない議論になっています。。。

(無題) 削除/引用 No.1549-2 - 2013/03/18 (月) 07:37:49 - U2 ウイルスのenvelope、GFPの発現をdriveするpromoter、GFPの検出系（flow cytometryまたはliveあるいは固定して蛍光顕微鏡）によって、いくつかのシナリオが考えられますが、個人的な印象では、最初の方の２回目の実験がfalse positiveのような気がします。 もし、envがVSVGで、一般的なpromoterでGFPを発現し、flow cytometryで検出しているのであれば、ある程度経験のある方がHEK293でinfectionしてうまく行かない（GFPが検出できない）というのは考えにくいです。よってウイルス産生までの過程（プラスミド、トランスフェクションなど）で何らかの問題があり、ウイルス溶液のtiter自体が低い（あるいは０）のではと考えます。ウイルス溶液採取時にpackaging細胞のGFP発現は確認されてますでしょうか？　あるいは、ウイルス溶液を凍結保存する前に、titerは確認されていますでしょうか？　もしtiterを見てあるのであれば、その時に使った細胞は何でしょうか？　 レンチウイルスで、一般的なpromoterを用いてGFPを発現している場合、1 copyのintegrationでもかなり光るので、検出系が問題になる事はまずありませんが、特殊なpromoterをお使いの場合は、1 copyでのintensityが、liveの蛍光顕微鏡の感度以下になる事もあるかもしれません。IRESでも、運が悪ければそのような事が起こりえます。その場合、感染したcopy数が多い細胞のみGFPが光る、という事になり、titerの高いウイルス溶液でないとliveの顕微鏡でのGFPの確認が難しいかもしれませんし、実験ごとに検出限度ぎりぎりのところで微妙にぶれて、再現性が取れないかもしれません。蛍光imaging用の顕微鏡か、flow cytometryであれば、かなり低い発現でも検出可能と思われ、GFPの検出系についても考えてみる価値があるかもしれません。

レンチインフェクション 削除/引用 No.1549-1 - 2013/03/16 (土) 06:18:50 - おお HEKをいじった細胞をつかっているのですが、同じバッチの培養液でもレンチの感染効率があんていしません。 ラボのあるひとが二回やって最初はだめだったけど2回目はよかったということで同様の培養液を同じ細胞に添加してみましたが、全く感染されてないようです。レンチはGFP発言ユニットを持ったものを使ってますので今のところGFPシグナルで評価しています。 まあ細胞の調子を整えるとか基本的なことはあるでしょうけど、もう少し踏み込んだ具体的な事が聞けると嬉しいです。

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