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(無題) 削除/引用 No.1572-17 - 2013/03/24 (日) 16:43:24 - おお 文献のリンク貼ったときに書かなかったんですが、その文献ではカルパインかプロテアソームか結論が出せないでいますね。

(無題) 削除/引用 No.1572-16 - 2013/03/24 (日) 16:39:03 - おお >[Re:14] ひまわりさんは書きました : > > という経験があるものですから、ん〜、その論文はピノサイトーシスで取り込んでるんじゃないんですか？ ピノサイトーシスはエンドソームを形成するので膜透過性がなければいずれにしろ細胞質にはいりませんよね、、、ただ細胞、コンディション、見るものによって入りにくいとかありそうですね。

(無題) 削除/引用 No.1572-15 - 2013/03/24 (日) 16:34:30 - ひまわり > > ミトコンドリアのカルパインの研究をしていたときもミトコンドリア外膜と内膜は透過しませんでしたね。 > すみません、外膜は透過したけど内膜は透過しなかったに訂正します。

(無題) 削除/引用 No.1572-14 - 2013/03/24 (日) 16:31:17 - ひまわり >[Re:12] おおさんは書きました : > >[Re:11] ひまわりさんは書きました : > > 細胞膜透過性がないから。 > > これについての情報源が欲しいと思いました。お時間が許す限りで結構ですので教えて頂ければとおもいます。 私が学生の頃ですから10数年以上昔のことです。 カルパインの研究をしていていろいろな基質を使って実験してた際、ほとんどの合成基質が赤血球膜を透過しないことがわかりました。 この中には当然、このトピで議論されている基質もつかっています。 ミトコンドリアのカルパインの研究をしていたときもミトコンドリア外膜と内膜は透過しませんでしたね。 ですからジギトニンとか界面活性剤を使っていちいち膜透過性処理していました。 今はどうだかわかりませんが、赤血球は他の細胞と違ってピノサイトーシスやファゴサイトーシスをしないという利点があり、μ/m-カルパインの研究には昔からよく使われていたんだと思います。 という経験があるものですから、ん〜、その論文はピノサイトーシスで取り込んでるんじゃないんですか？ 表題のようなプロテアーゼの合成基質の研究は1980年〜1990年代に盛んだったので、その辺の論文調べればわかると思いますし、たぶん私もカルパインやプロテアソームの基質に関する文献あると思いますので時間あったら見てみます。

(無題) 削除/引用 No.1572-13 - 2013/03/24 (日) 05:05:45 - おお http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9888455 The sample, with the cell-permeable substrate Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amino-4-methylcoumarin, was placed in a chamber, which was placed in a thermostat-controlled aluminum block.

(無題) 削除/引用 No.1572-12 - 2013/03/24 (日) 04:57:01 - おお >[Re:11] ひまわりさんは書きました : > 細胞膜透過性がないから。 これについての情報源が欲しいと思いました。お時間が許す限りで結構ですので教えて頂ければとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.1572-11 - 2013/03/23 (土) 19:13:36 - ひまわり 細胞膜透過性がないから。 培養細胞使ってもできるけど透過性処理しなければアッセイできません。 生きた細胞中の活性を見たいならプロテアソームのプローブ売ってるからそれを使えばいいんじゃない？ Me4BodipyFL-Ahx3Leu3VSとか使えると思う。

(無題) 削除/引用 No.1572-10 - 2013/03/23 (土) 14:42:21 - ma >~さん ご返事ありがとうございます。 論文の前後には、ライセートでは測定できる。しかし細胞内において測定することは困難。といったように詳しい説明は書かれておりません。 プロトコルについては、とりあえず細胞内で見たいと考えています。 ライセートではSDSによるプロテアソームの活性化が必要ですが、細胞内でも必要となるのでしょうか？必要ならば、26Sプロテアソームはポリユビキチン化されたタンパク質を認識した時にのみ活性化されるということですか？ 勉強不足で恐縮ですが、ご教授いただけると大変嬉しいです。

(無題) 削除/引用 No.1572-9 - 2013/03/22 (金) 16:43:53 - ma >おおさん なるほど、分かりました。 多くのアドバイスありがとうございます。大変勉強になりました。 ぜひ参考にさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.1572-8 - 2013/03/22 (金) 16:21:03 - おお >[Re:6] maさんは書きました : > >おおさん > > ご返事ありがとうございます。 > > >カルパインなどの基質にもなるようなので、いろいろなプロテアーゼのターゲットになり、プロテアソームだけの活性を見れないからかもしれませんね。vitroのあっせい方法はそういう配慮をしていたりしませんか? > > といいますのはライセートではカルパインやキモトリプシンといったプロテアーゼを選択的に除去できるような操作ができるということですか？ > 実はライセートを実際に使ったことがなく、勉強不足なので教えて欲しいです。 いやそれはわたしも具体的には見たことも調べたこともありませんから、、、あなたの実験に関係がありそうなことで、興味がおありみたいなのでお調べになるだろうとおもって、、、 たのかたの回答にありますがSDSを使うようでしたら、いろいろなタンパクの活性は変性などのためなくなるでしょうけど.

(無題) 削除/引用 No.1572-7 - 2013/03/22 (金) 16:20:28 - ma >~さん ご返事ありがとうございます。 論文の前後には、ライセートでは測定できる。しかし細胞内において測定することは困難。といったように詳しい説明は書かれておりません。 プロトコルについては、とりあえず細胞内で見たいと考えています。 ライセートではSDSによるプロテアソームの活性化が必要ですが、細胞内でも必要となるのでしょうか？必要ならば、26Sプロテアソームはポリユビキチン化されたタンパク質を認識した時にのみ活性化されるということですか？ 勉強不足で恐縮ですが、ご教授いただけると大変嬉しいです。

(無題) 削除/引用 No.1572-6 - 2013/03/22 (金) 16:07:01 - ma >おおさん ご返事ありがとうございます。 >カルパインなどの基質にもなるようなので、いろいろなプロテアーゼのターゲットになり、プロテアソームだけの活性を見れないからかもしれませんね。vitroのあっせい方法はそういう配慮をしていたりしませんか? といいますのはライセートではカルパインやキモトリプシンといったプロテアーゼを選択的に除去できるような操作ができるということですか？ 実はライセートを実際に使ったことがなく、勉強不足なので教えて欲しいです。

(無題) 削除/引用 No.1572-5 - 2013/03/22 (金) 13:45:16 - ~ >論文などでは細胞内においてはその活性の測定が困難、と書いてあります。 これの前後には何と書いてあるのでしょうか？ 細胞内に基質を入れることが困難な場合でも、細胞内においてその活性の測定が困難ですので、上記の文章は成立します。 また、測定系はどのようなプロトコルを想定しているのでしょうか？ プロテアソームをSDSで活性化する系であれば、安定にSDS処理を行うためにはlysateのほうが都合がいいでしょう。 基質を細胞に取り込ませるだけでなく、細胞を壊さないようにSDSを活性化に適した濃度になるように取り込ませ、各サンプル間でプロテアソームを均一に活性化させるのは、”困難”と表現してもいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1572-4 - 2013/03/22 (金) 13:42:02 - おお >[Re:3] maさんは書きました : > >おおさん > > ご返事ありがとうございます > もちろん細胞内に入るかは重要なポイントと思いますが、論文などでは細胞内においてはその活性の測定が困難、と書いてあります。 > つまり細胞内に入れる段階ではなく、入ったあとの測定の段階で問題があると考えられます。 > しかし、そのようなことを明記した論文が見つからないため困っています。 > 比較的低分子ですので細胞内に入れるのもそほど困難でなさそうですし、細胞内に入れた後になぜ測定が困難となるのかという点で、ご教授をいただきたいです。 細胞内に入るかどうかは試薬屋さんをいくらかみましたけど書いてないですね。比較的低分子といってもH2Oは膜を透過しませんけど、、、まあ構造見ると入ってもおかしくはないようなきがします。 カルパインなどの基質にもなるようなので、いろいろなプロテアーゼのターゲットになり、プロテアソームだけの活性を見れないからかもしれませんね。vitroのあっせい方法はそういう配慮をしていたりしませんか?

(無題) 削除/引用 No.1572-3 - 2013/03/22 (金) 12:48:55 - ma >おおさん ご返事ありがとうございます もちろん細胞内に入るかは重要なポイントと思いますが、論文などでは細胞内においてはその活性の測定が困難、と書いてあります。 つまり細胞内に入れる段階ではなく、入ったあとの測定の段階で問題があると考えられます。 しかし、そのようなことを明記した論文が見つからないため困っています。 比較的低分子ですので細胞内に入れるのもそほど困難でなさそうですし、細胞内に入れた後になぜ測定が困難となるのかという点で、ご教授をいただきたいです。

(無題) 削除/引用 No.1572-2 - 2013/03/22 (金) 01:56:05 - おお ちょっとこの物質については分かりませんけど、一般的に細胞にかけて細胞ないのものや出来事を検出するような試薬は細胞ないに入らないといけません。膜を透過しにくい物質はしばしそういう理由で細胞ないのイベントを検出することができません。一度そういう点でその試薬の情報をおさらいしてみてはどうでしょうか。

プロテアソーム活性の測定方法 削除/引用 No.1572-1 - 2013/03/22 (金) 01:24:23 - ma プロテアソーム活性の測定のためには，Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMCという物質が基質として一般的に使用されている様です。分解産物であるAMCの蛍光強度を測定するものです。 しかしこの物質はライセートで用いることが一般的であり、培養細胞中で用いることは困難とのことでした。なぜ細胞中では用いることができず、ライセートで用いることができるのかをご教授頂きたいです。 勉強不足かもしれませんが、よろしくお願い致します。

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