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(無題) 削除/引用 No.1592-10 - 2013/03/30 (土) 14:10:04 - Harmonia （１）新規っていうか、遺伝子Bと同じか違うかってことですよね？ 下記のNo.1592-7 APさんと同じ指摘ですが。 > ちゃんとB以外にマッチする遺伝子がXにはありマウスにないなら、新規性 > のある遺伝子かもしれませんが、そういう情報が不足しています。 ところで、トピ主さんが調製したRNAプール中には遺伝子B転写物は無い （発現組織とか時期が違う）っていうオチは？ > この動物種はゲノムプロジェクトが終了 っていうのも、意味するところが複数あってとらえどころがない。 ゲノムDNAは読み終えただけなのか？ ORFのアノテーションが出尽くしたのか？ 単にプロジェクトに充当された予算が切れたのか？ で、そもそも遺伝子Aと遺伝子Bの相同性はどのくらい？

(無題) 削除/引用 No.1592-9 - 2013/03/29 (金) 12:36:05 - おお ところで配列はどこまできれいに読めているの?シーケンスデーターのテキストだけ見ているっていうことはないでしょうね。 ってちょっと失礼な質問でした。。。

(無題) 削除/引用 No.1592-8 - 2013/03/29 (金) 12:33:40 - おお 一度NCBIでいいので、生物の対象をしぼらずすべての核酸でサーチしてみて100%にちかいヒットがないか確認した方がいいかもしれませんね。どこからかのコンタミを増やしている可能性も見ておいた方がいいとおもいますので。bcl2ファミリーをクローニングしたという報告のあとに、その遺伝子が大腸菌由来の配列とほぼ100%マッチしたというのをみたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.1592-7 - 2013/03/29 (金) 11:32:29 - AP おおさんの指摘とかぶりますが、 RT-PCR産物の配列を動物種Xのゲノムに対してblastをかけたらどうなりますか？ 遺伝子B以外にマッチするゲノム領域はあるのか、どの領域に落ちるのか？ 極端なはなし、RT-PCR産物の配列がシークエンス精度が低いなどによるアーティファクトで、ゲノム中にない配列かもしれないですよね。 また、RT-PCR産物の配列をマウスゲノムに対してblastをかけたら何にヒットするのか？　遺伝子A以外に類似の遺伝子はないのか。 ちゃんとB以外にマッチする遺伝子がXにはありマウスにないなら、新規性のある遺伝子かもしれませんが、そういう情報が不足しています。 やろうと思えば、RACEはキットなしでもプライマーやアダプターなどど、いくつかの酵素が少量あればできるでしょう。あるいは、どこかの研究室でXのcDNAライブラリーを持っているところがあれば、分けてもらってスクリーニングしてcDNAを得るという手もありますが。

(無題) 削除/引用 No.1592-6 - 2013/03/29 (金) 02:09:38 - おお >[Re:5] まるやまさんは書きました : > おお様 > > 次の方法が文を読んでるだけでは判らないので、もう少し詳しく教えていただけると有り難いです。 > > ”その配列をゲノムにアサインして目指していたlocus由来のものか、違うところから来ているのか、またはその遺伝子産物がゲノムの配列から発現しうる配列なのかまずはしらべてはどうでしょうか。” > > 得られた配列があなたの扱っている動物種のゲノムにあるかどうか、あったとして、得られた配列がそのゲノムの配列から転写されているか。たとえば、その配列の半分があるクロモソームのこりが違うクロモソームであれば、PCR自身をうたがうか、なにか一般的にいわれてないことがおこっているということになるでしょう。 ちょっとわからないのですが、目指している配列とは違ったものが出てきたわけですよね、、、目指している配列はもういいのですか?それとは別にその配列について突き止めようということですか? あとタンパク(アミノ酸配列)を抽出してそう同性のあるものにたいして重要なモチーフが保存されているかとかいう解析もした方がいいと思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.1592-5 - 2013/03/28 (木) 22:12:02 - まるやま 様々な御意見をありがとうございます。 まず補足します。 ミスマッチが全体的に散らばっている状態での70%です。またBLASTすると、マウスでは遺伝子Aと70%程度の相同性がありました。またマウスには遺伝子Aよりも相同性の高い遺伝子はなかったです。 そのタンパク質の機能を調べるところまでが目的です。 進化の過程でこの動物種Xで生じた遺伝子ではないかと考えています。何らかの予算を獲得して、RACEをしてみようと考えます。 おお様 次の方法が文を読んでるだけでは判らないので、もう少し詳しく教えていただけると有り難いです。 ”その配列をゲノムにアサインして目指していたlocus由来のものか、違うところから来ているのか、またはその遺伝子産物がゲノムの配列から発現しうる配列なのかまずはしらべてはどうでしょうか。”

(無題) 削除/引用 No.1592-4 - 2013/03/28 (木) 09:44:04 - ~ 目的がよくわからないのですが、マウスのオルソログの塩基配列（候補）を得ることが目的なのでしょうか？ それとも、その塩基配列からタンパク質が翻訳されることの確認までが目的なのでしょうか？ そのタンパク質の機能を調べるところまでが目的なのでしょうか？ RACEのキットが買えない予算で研究するのであれば、塩基配列を得ることができるかどうかだと思いますが。 （１） ゲノムプロジェクトが終わっているのであれば、検索すればどこの配列か分かるのではないでしょうか。 新規遺伝子の可能性があるために解析対象にするという意味であればいいのですが、今の時点で新規遺伝子と考えるのは早いと思います。 まさか、mRNA配列とゲノムDNA配列でイントロン配列の有無が異なるため、30%分のインサートが入っているとかではありませんよね。 （３） キットの価格は十万円ちょっとで、それが払えないのですよね。 現時点のラボの試薬には何があって、あといくらでどこまで進めたいのでしょうか。 発現を見るための今得ている塩基配列からプローブを作るにしても、新しくキットを買うのであれば数万円はかかります。 RACEのキットを自作するとしても、酵素とプライマーを発注することになるでしょうから、キットで買うよりも安上がりになるか疑問です。 十万円以下で済ませるとなると、打てる手は残り数ステップしかないのでは？ ノーザンで転写を確認して、全長を回収してその塩基配列を読むところまではできるのかもしれませんが、タンパク質が発現しているかの解析に使う抗体等が用意できないと思います。 予算の都合で一個十万円を超える品を買えないだけで、少額であれば購入できるというのであれば、代理店と相談してキットの試薬1本ごとに価格をつけてもらって、書類上は少額の試薬をたくさん買った（総額はキットと一緒）といった方法もあります。 あまり表でお勧めはできる方法ではありませんが。

(無題) 削除/引用 No.1592-3 - 2013/03/28 (木) 01:06:57 - おお >[Re:1] まるやまさんは書きました : > 以上の背景で３つの質問について御意見を教えてください。 > > （１）得られたRTPCRの増幅産物は、新規の遺伝子の一部だと考えても良いでしょうか？ その配列をゲノムにアサインして目指していたlocus由来のものか、違うところから来ているのか、またはその遺伝子産物がゲノムの配列から発現しうる配列なのかまずはしらべてはどうでしょうか。70%といっても100%の領域があって一部ギャップや違う配列の挿入があってトータルで70%なのか、とかミスマッチが全体的に散らばっているのかで判断も違ってくるでしょう。 > > （２）新規の遺伝子だとして、この遺伝子の開始コドンからストップコドンまでの配列を、NCBIなどで検索する方法は無いでしょうか？ ゲノムの配列がてに入るんだから上記に書いたアプローチとプレディクションをふくむその生物種のmRNAのホモロジー検索をすればいいのでは? > > （３）得られたRTPCRの増幅産物の配列をスタート材料にして５Raceや３Raceをして開始コドンからストップコドンまでの配列を調べる事ができるらしいという事は成書を読んで知りました。しかし、予算の関係で、５Raceや３Raceのキットを購入する事はできません。何か良い方法は無いでしょうか？ ゲノムの配列を参考にしながらRTーPCRとノーザンなどを組み合わせて可能性を探ればどうでしょうか。 やるかどうかはおいといてRACEキットの中身をみればまあきっとでなくてもすむというのは気付くとはおもいますけど。モレキュラークローニング何かに載ってるんじゃない?

(無題) 削除/引用 No.1592-2 - 2013/03/27 (水) 22:45:53 - qq （１）そりゃ判らんよね。 （２）blastが正攻法でしょ？　マウスのオーソログを探すのが、簡単ではあると思います。遺伝子Bとは70%といってたけど、マウスの遺伝子Aとはどうだったのでしょう？遺伝子Aよりも相同性の高いマウス遺伝子はなかったのですか？

新規の遺伝子（？）の配列の調べ方 削除/引用 No.1592-1 - 2013/03/27 (水) 22:23:21 - まるやま はじめまして。いつも勉強させていただいています。 ある哺乳動物種Xの研究をしている者です。この動物種はゲノムプロジェクトが終了しています。 マウスで報告されている遺伝子Aに興味をもち、遺伝子Aの名前で、NCBIで検索した所、動物種XにもPREDICTと名前の先頭についた遺伝子Bがある事が検索できました。 そこで遺伝子Bの配列を基にプライマーを合成し、動物種X由来のtotal RNAを材料にしてRTPCRをして、得られた増幅産物のシーケンスをしました。しかしシーケンス結果の配列をクエリーにしてBLASTした所、遺伝子Bとの相同性は70%程度しかありませんでした。 以上の背景で３つの質問について御意見を教えてください。 （１）得られたRTPCRの増幅産物は、新規の遺伝子の一部だと考えても良いでしょうか？ （２）新規の遺伝子だとして、この遺伝子の開始コドンからストップコドンまでの配列を、NCBIなどで検索する方法は無いでしょうか？ （３）得られたRTPCRの増幅産物の配列をスタート材料にして５Raceや３Raceをして開始コドンからストップコドンまでの配列を調べる事ができるらしいという事は成書を読んで知りました。しかし、予算の関係で、５Raceや３Raceのキットを購入する事はできません。何か良い方法は無いでしょうか？ よろしくお願いいたします。

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