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(無題) 削除/引用 No.2427-22 - 2013/10/10 (木) 10:46:18 - せせ いろいろな遺伝子のmRNA量の絶対定量をしたい人がどれくらいいるか分かりませんが、10年もすれば、逆転写反応を伴わない定量とか逆転写反応の苦手な点を克服するような装置、キットが普及してるかも？？してない？？

(無題) 削除/引用 No.2427-21 - 2013/10/10 (木) 07:08:18 - TTX BioRadのQX100 digital droplet PCR systemをCopy number variationとRare variant mutationの検出に使っていますが、低コピーから高コピーまでかなり安定した結果が出ますよ。コピーナンバーで言えば、3 well間のCVは1-2%ぐらいです。 ただ高い正確性や絶対定量を必要とする研究がそんなに多くないので、特殊な用途以外では安価で確立されているqPCRを置き換えるほどではないかな、という印象です。

(無題) 削除/引用 No.2427-20 - 2013/10/09 (水) 23:16:57 - 直輝 PCRさん、paさん お返事ありがとうございます。私からもう付け加えることはないですが、ご指摘の点はそのとおりだと思います。 デジタルPCRについては、qPCRで定量しにくいようなローコピーの遺伝子には非常に有用な技術だと思います。 ただし、このトピックで指摘されている逆転写効率の違いに関してはどうにもならないですが…。その後のDNAのコピー数ならカウント可能でしょう。 機器を販売するメーカーも増えてきているみたいだし、ある程度は普及しそうです。

(無題) 削除/引用 No.2427-19 - 2013/10/09 (水) 14:01:32 - でじたる Real-Time PCRより更に便利そうな印象を受けます。専用の装置がお高いのでしょうか。 www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/qpcr-education/qpcr-vs-digital-pcr-vs-traditional-pcr.html

(無題) 削除/引用 No.2427-18 - 2013/10/09 (水) 10:18:33 - んぐ 定量PCRでも他の方法でも、検出する配列によって量が違う結果になりませんか？ 逆転写の効率の違いが原因として大きいように思ってますが、ともかく、この 議論を遺伝子間ですることにあまり意義を感じません。 サンプル間の比較をそれぞれの遺伝位の転写産物の倍率変化とか変化速度とか を出しておいて、それを遺伝子間で比較するなら意味はあると思います。

(無題) 削除/引用 No.2427-17 - 2013/10/09 (水) 04:06:29 - NUPD 10年以上前の話ですが… PCR産物をアガロースに流してバンドを切り出し、 そこからプロダクトを抽出したものを使って スタンダードカーブ作成に使ってました。 この場合吸光度を測定し、プロダクトのモル数を計算した上で コピー数を算出して絶対定量をしていました。 一応ノンスペが増えていない事の確認にもなりました。 ただ、何回か使った後や実験の期間が開いたら取り直してました。 凍結融解等によるcDNAのDegradationがこわかったので。。。

(無題) 削除/引用 No.2427-16 - 2013/10/09 (水) 03:01:03 - pa 直輝さん、PCRさんの論点に関して、PCRさんのコメントに補足ですが、 B)について、直輝さんが示唆されているように、cDNA自体も阻害的に働きうると思います。cDNAに含まれている、プライマー・ターゲット配列に低い相同性をもつ分子が、プライマーとターゲット配列のアニーリングを邪魔するとか。

(無題) 削除/引用 No.2427-15 - 2013/10/09 (水) 02:18:52 - PCR 直輝さん 私もその可能性を考えていました。 A) 組織のcDNAを加えることによって、プラスミドDNAのチューブへの吸着が防がれた。プラスミドDNAの量がそれなりにあれば、多少吸着しようが大勢に影響はないですが。 そうなんです。プラスミドDNAの量がそれなりにあれば大勢に影響は無いと思うのです。ところが、実際に検量線をきちんと引くとなると、段階希釈の結果濃度の低いのはかなり少量になってしまいますよね。こういうのをきちんと考慮しているのかどうか。 B) マウス組織の抽出物が夾雑物となっているのか 非常にありえると思います。というか恐らくはメインの理由だろうと。しかし、これを完全に避けるのって無理ですよね。RNAの抽出をTRIzolからカラム式のものに変えたりするという手もあるのでしょうが、これも完全では無いですし。 仰る通り、自分が示したいことによって、どれ位の厳密さが必要なのかをきちんと考慮しないといけないと思うのですが、きちんとできてる場合ってのは実はかなり少ないように思います。 各組織における遺伝子Aの発現量をリアルタイムPCR法で比較しました、なんてデータは結構見かけるのですが、きちんとした実験デザインが出来てないと、先に書いた通り、実際に発現量が同じでも容易に2倍近く、あるいは2倍以上の差が"みかけ上"あるようなデータになったりするわけです。単純に組織別発現量の比較をしました、ならまあそれでも良い(いや、本当は良くはないけど)ですけど、ある疾患によって遺伝子Aの発現量が倍増しました、というのが論文のメインの主題なのに、実験デザインがザルだったりすることはよくあります(レビューでよくこの点突っ込んでます)。

(無題) 削除/引用 No.2427-14 - 2013/10/08 (火) 13:04:04 - se ちょっと最近聞いた機器でdigital PCRって言う装置は、この質問の実験に使えないのですか？素人なので、まったく当て外れだったら申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.2427-13 - 2013/10/08 (火) 12:51:05 - R >「コントロール遺伝子と任意の遺伝子の発現量を比べる」ことと「コントロール遺伝子でNormalizeされた各遺伝子の発現量を比べる」ことにどういった差があるのだろうと思い 後者は、normalizeされた発現量について、wtとmtとかcontrolとtestでの比較に続くものと考えます。 なので、"各遺伝子の"ではなく"各遺伝子で"の意味合いで使われるのが今のところ一般的ではないでしょうか。 前者については、今のところの技術ではmRNAに関しては難しいのではないでしょうか。 real-time PCRでは、その目的のための手法として今後も適さないでしょうし、RNA seqは可能性はあるかなと思っています。

(無題) 削除/引用 No.2427-12 - 2013/10/08 (火) 11:30:54 - おお mRNAの発現量という枠だけで考えるなら、相対的なものととらえるのがしぜんなだけで、実際にコピーナンバーを調べるというのにもつかわれてますからね。 RTPCRであればRTの効率も影響するので定量するときはRNAをつくってスタンダードにしたほうがいいという話もありますね。

(無題) 削除/引用 No.2427-11 - 2013/10/08 (火) 11:24:07 - せみ ＞qPCR自体ほぼ比較定量のための方法ではないでしょうか？ おっしゃるとおりです。ただ、「コントロール遺伝子と任意の遺伝子の発現量を比べる」ことと「コントロール遺伝子でNormalizeされた各遺伝子の発現量を比べる」ことにどういった差があるのだろうと思いお尋ねさせていただきました。 RNA-seqについてはやったことないのですが、PCRさんのおっしゃるとおり、本当に絶対定量したいならばそれぞれプラスミドを作るなどの工夫が必要みたいですね…。

(無題) 削除/引用 No.2427-10 - 2013/10/08 (火) 06:15:08 - 直輝 PCRさんの経験は、以下の２種類の可能性が考えられるかもしれません。 A) 組織のcDNAを加えることによって、プラスミドDNAのチューブへの吸着が防がれた。 B) 組織のcDNA溶液がPCRの増幅効率を低下させた。 A)はプラスミドDNAの量がそれなりにあれば、多少吸着しようが大勢に影響はないですが。 B)は、組織のcDNA自体が原因なのか、組織のcDNAに混入しているマウス組織の抽出物が夾雑物となっているのか。 絶対定量も結構難しいというのには同意します。どこまで「厳密さ」が求められるかが問題ですね。 話がさらに脱線しちゃいますが、ELISAでもサンプルのウェルと検量線のウェルでは夾雑物の有無の違いがあるので、サンプルの方が値が低くなりがちなのはよく知られた問題です。

絶対定量も結構難しい 削除/引用 No.2427-9 - 2013/10/08 (火) 03:04:40 - PCR 話が少し横にそれてしまいますが、Real Time PCR による定量、特に絶対定量ってどれ位信用できるものなのでしょうか? 絶対定量って、例えばPCR産物なりプラスミドDNAなり、計量して濃度が予め分かっているものを段階希釈してPCRをかけ、計量線を引いてコピー数を計算する方法ですよね?過去に次のような実験をしたことがあります。 1) プラスミドDNA 2) 1)と同じ量ののプラスミドDNAを、マウスの各組織からRTして作ったcDNAと混ぜたもの を準備して、トータルのDNAの量では無く、含有するプラスミドDNAの量が同じになるようにサンプルを調整。そしてプラスミドDNA内のDNAを増やすプライマーでPCRをかけてみました。その結果、加える組織のcDNAによってCt値が変わるということがありました(プラスミドだけだと21.9なのが、Brain cDNAを足して23.4、Liverだと22.6になったとか。またマウス由来のcDNAだけではPCRがかからないことは確認済み)。 まず自分自身でやってみて、次に腕のしっかりした大学院生にも頼んでみたのですが、同様な結果になったので、手技的な問題では無いと思います。Ct値で平均1.5の差は大きくて、これは無視出来ないなと思ったものです。 絶対定量であれば無理がないかな、と本文にありましたが、二組以上のコントロールDNA(とプライマーセット)を使うことになると思うので、かなりきちんとした条件検討が必要になると思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.2427-8 - 2013/10/07 (月) 23:57:15 - 直輝 >RNA seqの方が理論的にましだと思います。 本当にそうでしょうか？ RNAseqだってPCRでの増幅過程がある以上、配列によって増幅しやすいorしにくい遺伝子があります。（DNA増幅を伴わない次世代シーケンサーなら別ですけどね、Nanoporeとか。誰か使ったことある方いませんか？） だから、RNA seqのRPKMの値を異なる遺伝子で比較するのだって、「目安」にしかならないと思ってます。 質問内容の目的"だけ"だったら、自分はコスパ的にリアルタイムPCRで絶対定量するか、相対定量で済ませる方法（可能なら）を選ぶと思う。

(無題) 削除/引用 No.2427-7 - 2013/10/07 (月) 21:07:55 - 7744 > リアルタイムPCRによって完璧に発現量を定量出来るとお考えですか？ そんなことは全く思っていません。 私の言っている「定量」は数値として比べられるという意味です。 発現量自体を定量したデータを出したいなら、ちょっとだけさんの言うような方法もあるかとは思いますが、私は迷わずRNA-seqを使います。 qPCR自体ほぼ比較定量のための方法ではないでしょうか？ その過程で、どこかをしっかりと揃えてやることによって、せみさんの言う定量ができるのだと思います。 > コントロール遺伝子のプライマーと興味ある遺伝子のプライマーがあったとして。 横軸に転写産物、縦軸に蛍光強度を取ったとしましょう。 グラフは当然重なりません。では傾きはどうでしょうか。 我々は「一次関数のグラフになる」ことを前提として実験をしているはずです。 それはそうでしょう。よほどでない限り重ならないでしょうね。 だから比較定量ではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2427-6 - 2013/10/07 (月) 17:59:42 - R RNA seqの方が理論的にましだと思います。 real-time PCRでは、「目安」の域は出ないと考えます。 >文献によってはたまにされていますが、あまりメジャーな方法ではないような気がしています。 マイナーというよりも、通常はreviewの段階で修正が求められるはずです。 (それが正しいかどうかは別にして) >それを証明するのは困難ですが。 と仰るように、証明できてないから目安にしか成らないのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2427-5 - 2013/10/07 (月) 17:26:30 - ちょっとだけ > リアルタイムPCRによって完璧に発現量を定量出来るとお考えですか？ できなくはないです。 モル濃度がわかっているコントロールで検量線を引けばコピー数が定量できますし、やってる方もいるはずです。条件検討をしっかりやる必要はあります。 > コントロール遺伝子のプライマーと興味ある遺伝子のプライマーがあったとして。 > 横軸に転写産物、縦軸に蛍光強度を取ったとしましょう。 > グラフは当然重なりません。では傾きはどうでしょうか。 > 我々は「一次関数のグラフになる」ことを前提として実験をしているはずです。 > それを証明するのは困難ですが。 異なる条件下での特定の遺伝子の発現を比べる場合は、コントロールの傾きと異なっていてもそんなに問題にはならないと思うのですが。 そもそも、どんな実験でもコントロールはおきますが、あくまで同じ細胞数なりDNA量なりRNA量なりタンパク質量があるという「目安」でしかありませんよ。

(無題) 削除/引用 No.2427-4 - 2013/10/07 (月) 17:01:04 - せみ ＞おおさん 詳しくありがとうございます。プライマーの検討が第一だと感じました。 ＞7744さん リアルタイムPCRによって完璧に発現量を定量出来るとお考えですか？ コントロール遺伝子のプライマーと興味ある遺伝子のプライマーがあったとして。 横軸に転写産物、縦軸に蛍光強度を取ったとしましょう。 グラフは当然重なりません。では傾きはどうでしょうか。 我々は「一次関数のグラフになる」ことを前提として実験をしているはずです。 それを証明するのは困難ですが。

(無題) 削除/引用 No.2427-3 - 2013/10/07 (月) 12:56:35 - 7744 > 前者の方法でもコントロール遺伝子と任意の遺伝子において同じことが言えると思えます。 思わないでください。全く言えません。 言えてしまうと一大事です。

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