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(無題) 削除/引用 No.365-11 - 2012/04/15 (日) 12:12:44 - モモ ここで何度か指摘していますが。 スキャナで取り込んだデータをＯＤ値に変換せずに定量するのは原理的に間違いです。スキャナーのＣＣＤは光の量を測定しているだけなので、データを反転したところで蛋白量には比例しません。 デンシトメーターを使うのは正しいやり方です。 スキャナを使うのであれば光の量のデータからＯＤを計算しなくてはなりません。

(無題) 削除/引用 No.365-10 - 2012/04/10 (火) 15:03:19 - LET qqさん，TSさん> 詳しいご説明，コメント有難うございます． この分野についてはまったくの素人で呆れさせるような質問ですみません． 自分でもいろいろ調べてみたのですが，どうやらそこまで直線領域が広いものではないようですね．文献や特許例などを見ると低濃度の20倍範囲くらいでは直線関係を示し，定量しているデータもありました．試験系としてはバンド強度の百分率による不純物強度の定量を想定しているので，直線域を検討してみます．

(無題) 削除/引用 No.365-9 - 2012/04/10 (火) 11:43:53 - qq 基本的に勅撰近似できませんから www.enzolifesciences.com/ADI-SPP-721/erp72-human-recombinant-his-tag/ のjpgファイルを使って、バンドを囲んで測定したものを表計算でBGを除去したのが以下のとおりです。（コンマ切りで見づらいなあ） 最初の列と最後の列（シグナル＊面積）を使ってグラフにします。 まさか直線で近似していませんよね？試行錯誤して適当なカーブを探しましょうね。 曲線を直線近似して相対誤差を出すのはよしましょうね。 "protein,ug", "area", "mean",　 "mean-bg", "area*(mean-bg)" 0, 9709, 19.632, 0, 0 0.25, 842, 73.496, 53.864, 45353.488 0.5, 782, 128.903, 109.271, 85449.922 1, 1120, 143.554, 123.922, 138792.64 2.5, 1504, 186.144, 166.512, 250434.048 5, 2073, 200.35, 180.718, 374628.414

(無題) 削除/引用 No.365-6 - 2012/04/10 (火) 11:13:17 - TS ＞なんとか検出はでき，回帰直線を描けるようになったのですが， ＞直線性，真度（高濃度溶液からの希釈倍率から理論的に得られると考えられるバンド強度からのズレ；相対誤差），精度はどのくらいあるものか判断がつきません． このあたりはご自分で標準化するところではないのですか。 既知濃度の抗体やタンパク質があれば、検証できますよね。 ばらつきがあるようなら、Dulipicate、Triplicateにするとか。 熟練度や技術力は人それぞれなので。 それに回帰線が直線である必要もないと思います。

(無題) 削除/引用 No.365-5 - 2012/04/10 (火) 09:31:19 - LET 具体的スキャン手順，参考になりました．ありがとうございました． スキャン条件を確認したところ，ご提案いただいた条件と同じでした． なんとか検出はでき，回帰直線を描けるようになったのですが， 直線性，真度（高濃度溶液からの希釈倍率から理論的に得られると考えられるバンド強度からのズレ；相対誤差），精度はどのくらいあるものか判断がつきません． どのくらいものか，一般的な回答で無くてもよいです．ご自分が実施した経験ではこんなものだったという情報でも助かります．是非よろしくお願いします．

(無題) 削除/引用 No.365-4 - 2012/04/06 (金) 09:42:03 - qq SDS-PAGEの１レーンが4mm幅のミニゲルだとして、 適切な標準タンパク質を0.01から10ugまで系列希釈する。 分析する抗体を0.1,0.3,1,3,10ugを準備する。 サンプル調製は、＋50mM DTTで、沸騰水浴中5分の処理が必須だと思います。 それぞれをSDS-PAGEで泳動して、CBB染色し、スキャナで読む。 スキャナで読むときに、 1) 48bitカラーか、赤色のチャンネルか緑のチャンネルの16bitグレイスケールで読みます。 2) 48bitカラーの画像であれば、赤と緑のチャンネルを平均（もしくは最大値をとる）します。 3) シグナルを反転します。結果的にグレイスケールの黒いバックグラウンドの画像が得られます。 4) バックグラウンドを適切に取り除き、それぞれのバンドを選択して、選択領域のシグナルの総和（面積 x 平均シグナル強度）を測定します。 分析する抗体試料中の1%の夾雑物は、10ug protein 試料中に、0.1ug入っている計算になるので、1%検出感度を維持できそうに思います。 いずれにしても、0.1ug程度のバンドを比較的適切に評価することができるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.365-3 - 2012/04/05 (木) 19:45:18 - LET 早速のレスありがとうございます． 事情がありCBB染色が前提条件となります． タンパクアプライ量を増やして感度を稼いでいるのですが，定量性がいまいちよくないと思っているのですが，どれくらいの定量性が得られる分析方法なのかもよくわからず，困っています． 何かありましたらよろしくお願いします．

(無題) 削除/引用 No.365-2 - 2012/04/05 (木) 11:08:02 - TS 感度の高い染色法に変更してはだめですか? 銀染色なんかが古典的ですが、最近は蛍光色素を使った簡単なものがたくさんありますよ。もしかしたら、可視でも感度の高いものもあるかも。 蛍光だとBio-radのOrioleとか、Sypro関係とか。

SDS-PAGEでの純度試験の設定 削除/引用 No.365-1 - 2012/04/05 (木) 10:18:16 - LET SDS-PAGE（CBB染色）により，抗体の純度試験を設定しようとしています．デンシシトメーターによる定量を行うのですが，定量下限付近のバンド強度が得られずに困っています．タンパクアプライ量は10ｇとし，定量下限はこの1%を目指しています．感度を上げるのに何かよい方法はないでしょうか？ また，こういった試験方法を設定する際にデンシトメーターでの直線性，精度はどのくらいあるものなのでしょうか？一般的な回答で無くてもよいです．ご自分が実施した経験ではこんなものだったという情報でも助かります．是非よろしくお願いします．

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