皆様、こんばんは。
気になることがあるので質問させて頂きます。
今、私は CRISPR/Cas9システムを用いて、ノックアウト魚を作製しています。
現在は、過去の先輩が購入した、Origine社のpT7-guideベクター(GE100013)を用いて合成したgRNAと、pT7-Cas9ベクターを用いて、実際にインジェクションしていますが、変異が見られなくて、手詰まり状態です。さらに、上記のベクター(GE100013)を用いた論文が見つけられず、参考にできそうなものもない状態です。
これは稚拙な考えなのですが、このベクターは、gRNAを合成する際に、5'末端に不要な3〜4塩基を付けるので、それがゲノムとの結合を妨げている、もしくはCas9蛋白の切断を妨げていると考えています。
そこでお尋ねしたいのは、pT7-guide ベクターを用いて実際にノックアウトを行った人はいらっしゃるのか、また、合成されたgRNAの5'末端に余分な塩基が付加していた場合、ノックアウトの弊害となりうるのかという2点です。
分かりにくい文章だとは思いますが、ご回答よろしくお願いいたします。 |
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