Bio Technical フォーラム

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酵素精製法 トピック削除
No.6041-TOPIC - 2017/06/10 (土) 11:33:47 - おすし
いつもお世話になっております。

グラム陽性菌の膜に局在するプロテアーゼを可溶化し、粗酵素液を得ることが出来ました。

当然のようにSDSーPAGEを行うと複数のバンドが出てしまいます。
イオン交換でバンドを減らそうとしているところですが、そもそも目的のプロテアーゼがバンドとし確認できるかも定かではありません。

今のところプロテアーゼ活性染色などを検討しておりますが
皆さんはどのような方法を試されているのでしょうか。
よろしくお願い致します。
 
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(無題) 削除/引用
No.6041-8 - 2017/06/12 (月) 12:37:47 - 大腸菌の発現
最終的な実験目標がわからないので,アドバイスの方向性がわかりませんが
単一精製が目標ならば・・・

>そもそも目的のプロテアーゼがバンドとし確認できるかも定かではありません。
タンパク量が十分にあれば,SDS-PAGE/CBB染色で見れるはずです。
とりわけ精製後で,バンドが見れないのは
抽出したタンパク量が不十分なことによると思います。(菌体量を増やす・・・)
サンプル濃縮,銀染色を行えば,(モノさえあれば・・・)見えるはずです。

>プロテアーゼ活性染色など
粗抽出であるため,他のプロテアーゼも混入していると思いますので,
ザイモグラフィーはやっていた方が無難だと思います。
(基質が最適ならば,CBBに染まらない微量でも検出できる)
できれば,ウエスタンブロットも・・・


monさまのアドバイス通り
>組換えタンパク発現・精製の方が早いかも。
だとも私は思います。配列がわかっていればですが・・・

(無題) 削除/引用
No.6041-7 - 2017/06/11 (日) 14:41:42 - mon
タンパク精製の成書は数多いので、まずは図書館行ったら。。

(無題) 削除/引用
No.6041-6 - 2017/06/11 (日) 14:34:38 - mon
3~5種のクロマトを組み合わせるのが普通かと。
昔は材料調製入れて1~5年がかりとか普通でしたが、培養機器・クロマト機器・カラムの性能が向上したので材料さえ豊富であれば3ヶ月、長くて1年か(お金があれば)。
場合によっては(全ゲノムシークエンス>)DBサーチ>遺伝子クローニング(or コドン最適化・遺伝子合成)>(タグ付き)組換えタンパク発現・精製の方が早いかも。

(無題) 削除/引用
No.6041-3 - 2017/06/10 (土) 12:25:11 - おすし
おおさん

そうですよね。
クロマトで単一バンドに出来る気がしなくて、、
つい質問してしまいました。

すいません

(無題) 削除/引用
No.6041-2 - 2017/06/10 (土) 12:16:58 - おお
>粗酵素液を得ることが出来ました。
粗精製溶液ができた事が何故わかったんですか?その方法でフラクションを見ていけばいいだけの話かと。

酵素精製法 削除/引用
No.6041-1 - 2017/06/10 (土) 11:33:47 - おすし
いつもお世話になっております。

グラム陽性菌の膜に局在するプロテアーゼを可溶化し、粗酵素液を得ることが出来ました。

当然のようにSDSーPAGEを行うと複数のバンドが出てしまいます。
イオン交換でバンドを減らそうとしているところですが、そもそも目的のプロテアーゼがバンドとし確認できるかも定かではありません。

今のところプロテアーゼ活性染色などを検討しておりますが
皆さんはどのような方法を試されているのでしょうか。
よろしくお願い致します。

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