Bio Technical フォーラム

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超速qPCR トピック削除
No.6049-TOPIC - 2017/06/13 (火) 09:36:26 - あかね
すぐに終わるように、qPCRのプロトコルを見直せないかと思っています。
denaturationやelongationをもっと短くできないかと思っていますが、経験のある方いらしたら教えてください。例えば、95Cは1secでもOKだとか。。

現在は、以下のようなプロトコルでやっています。
95C 1 min
*95C 15 sec
*60C 30 sec　*30cycle
PCR ampliconの長さは140 bpです。
試薬はTHUNDERBIRDです。
　
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技術としては 削除/引用
No.6049-6 - 2017/06/13 (火) 15:39:59 - ema
試薬のプロトコールをみると
95℃, 20〜60sec.
↓
95℃, 1〜15sec
60℃, 30〜60sec.
40 cycles
です。他のかたも言っていますが、検討の余地はあると思います。
ABIの純正での最初に提示されるプロトコールは
95℃, 20sec.
↓
95℃, 1sec
60℃, 20sec.
40 cycles
なので変えても良いならできるのでは。
早い、だけに着目し新技術でいいなら
機器も試薬等が全く異なりますが東芝が、シビアな場所でも（感染現場）で短時間で検出できる技術はあります。
http://www.toshiba-medical.co.jp/tmd/products/dnachip/genelyzer_F/index.html

酵素を変える 削除/引用
No.6049-5 - 2017/06/13 (火) 13:22:50 - かんちゃん
メーカーのプロトコールをみると、toyoboのthunderbirdはそれほど早さを狙った酵素では無いように見えます。
BioRadのSsoFastなど早さをうたっているものに変えるのもよいかもしれません。
denaturation 1-5sec, annealing/extension 1-5sec.
ただ、酵素を変えるとかからなかったり、meltがあまりきれいで無くなったりしたことがありました。

お使いのPCRマシンにもよりますが、annealing & extensionをできうるかぎり高い温度で行えば、denatureとの温度差が減りますので時間短縮になります。
これはプライマー配列などによってできない場合もあります。

melt curveも、高めの温度から見始めればそれだけ時間短縮にはなるかと。

でも、それらで得られる時短はおそらく10-15分程度で、最適化にかかる手間暇考えるとtotalではあまり時短にならないと思います。

(無題) 削除/引用
No.6049-4 - 2017/06/13 (火) 13:10:29 - おお
やってみないとわからないでしょうけど、、、いじった方がいれば情報がもらえるかもですね。
定量のやり方にもよるかもしれません。dCTだけで処理するのか、スタンダードを取るのか。スタンダードを取った場合は効率の変動をある程度はカバーできるので。増えるかどうかだったら95C 5 sec 60C １0 secでも大丈夫だと思います。

(無題) 削除/引用
No.6049-3 - 2017/06/13 (火) 10:08:59 - seventh
機器によって性能が違うのでなんとも。また、基本のプロトコルはサンプル等に多少の変動があっても対応できるような安定した条件で書いてあるはずです。
なので、それを外れる場合はサポート＆補償は期待できないので実際に行うつもりならまず指導教員に相談して下さい。

(無題) 削除/引用
No.6049-2 - 2017/06/13 (火) 10:07:05 - mon
ampliconの配列、機器の性能（測定ウェルに位置にも注意）、反応液量、鋳型由来の阻害物質量、チューブの性質（厚み等：熱伝導）によって変わるので、ご自身で試行錯誤するしかないと思います。
現在のプロトコルは、上記変動要因を幅広くカバー出来る条件だと思いますので、短縮は可能でしょう。

超速qPCR 削除/引用
No.6049-1 - 2017/06/13 (火) 09:36:26 - あかね
すぐに終わるように、qPCRのプロトコルを見直せないかと思っています。
denaturationやelongationをもっと短くできないかと思っていますが、経験のある方いらしたら教えてください。例えば、95Cは1secでもOKだとか。。

現在は、以下のようなプロトコルでやっています。
95C 1 min
*95C 15 sec
*60C 30 sec　*30cycle
PCR ampliconの長さは140 bpです。
試薬はTHUNDERBIRDです。
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