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(無題) 削除/引用 No.6076-11 - 2017/06/29 (木) 15:06:34 - mon > 先生にニトロセルロースに変えてみたいといったら、ＰＶＤＦの方が吸着能が高いからかえるなと言われてしまいました… 前にも記載しましたが、疎水性の強いタンパクはPVDF膜だと吸着が強すぎて？抗体が結合できないようです(epitopeが表面に露出しない？）。 StrepTag2もPVDF膜ではなくニトロセルロース膜指定でした（実際に試してもそうでした）。

(無題) 削除/引用 No.6076-10 - 2017/06/29 (木) 14:00:00 - ぽん >monさん ゲルを洗うんですね！ やってみます！ありがとうございます！ >ニトロセルロースさん 先生にニトロセルロースに変えてみたいといったら、ＰＶＤＦの方が吸着能が高いからかえるなと言われてしまいました… 論文かき集めてもう一度トライしてみます！

(無題) 削除/引用 No.6076-9 - 2017/06/28 (水) 12:29:36 - ニトロセルロース 以前、同様のことで悩んだことがあります。 ニトロセルロース膜で試してみてください。 各メーカーのPVDF膜を試してみてもポジコンすら全く検出できず悩んでいたある日、アミロイドβをWesternで検出している文献では、ことごとくニトロセルロース膜を使用していることに気が付きました。試しに手元にある古いニトロセルロース膜を使ったところばっちりと検出できましたよ。

(無題) 削除/引用 No.6076-8 - 2017/06/28 (水) 11:38:15 - mon >転写の時、SDSを除くというのは、切り取るということですか？ いえ、ゲルを転写bufferで5-10分洗う、という操作です。ゲル内の余分な（タンパクに結合していない）SDSを除く操作です。ただしやり過ぎると目的タンパクも流出するかも？？

(無題) 削除/引用 No.6076-7 - 2017/06/28 (水) 10:51:39 - ぽん >中年さん ureaは入れていませんでした。今後検討して、挑戦してみたいと思います。 サイトも、さらっとしかみていなかったので、じっくりよみたいと思います。 ありがとうございます。 >おおさん APPが発現されてることは確認できました。合成アミロイドベータペプチドを200nMという、濃すぎる量をいれているにもかかわらず、全く検出できません。 先輩は私と全く同じ方法で行ったら合成アミロイドベータペプチドは検出できたようです。 なぜ私がやるとでないのか分かりません。 一つ一つやり方を確認して貰ったのですが方法はまちがっていないはずですなのですが… >みさん 先任が全細胞破砕物中にAPPを確認したので、合成中間体は特に確認していないようです。 >monさん PDF膜は0.22nmのを使っています。 転写の時、SDSを除くというのは、切り取るということですか？ 今は、front dye以下を切り取っているのですが、この方法以外にもSDSを取り除くことが出来るのでしょうか？ MetOH添加量を増やしてみたいと思います！ 他にもメンブレンやWB以外の方法も検討してみたいと思います。 皆さん素早いご助言ありがとうございました！ 何回も行っても全くでないので挫けそうでしたがもう少し頑張りたいと思います！

(無題) 削除/引用 No.6076-6 - 2017/06/28 (水) 10:16:35 - 中年 そういえば知り合いが苦労していました。サイズをきちんと見るためにureaの入ったゲルを使っていたような。 それはともかく、"abeta western"で検索するとプロトコルやtipsを紹介したサイトがいろいろ見つかりますが、そういうのは見てみましたか。

(無題) 削除/引用 No.6076-5 - 2017/06/28 (水) 01:26:20 - おお ＡＰＰ導入だけでアミロイドができているのかどうか疑ったことはありますか？お使いの抗体はアミロイドスペシフィックでAPPは認識しないようですが、導入されたAPPの発現はどのように確認していますか？もし内在性のAPPが発現していたとすると、少なくとも同等のレベルかそれよりは多い量ほしいと思いませんか？ また何かポジコンになりそうなものはありませんか？合成ペプチドから作ったアミロイドでもいいかもしれませんけどその場合は量に注意を。

(無題) 削除/引用 No.6076-4 - 2017/06/27 (火) 16:38:29 - み Westernで検出できないとのことですが、細胞染色では合成中間体は検出されているのでしょうか？ゴルジ体、小胞体の中の合成中間体ね。

(無題) 削除/引用 No.6076-3 - 2017/06/27 (火) 16:34:42 - mon アミロイドβの検出は行ったことがありませんが、4.4kDaと小さいタンパク(ペプチド）なので一般的な注意を。 PDF膜は、0.45um pore sizeのものより、0.22um pore sizeのものの方が保持能が高いです。 transfer時に、ゲルからSDSをしっかり除きましょう。転写bufferも保持能を下げるSDSは不含の組成で行います。保持能をあげるためMetOH添加量を上げてもよいかも。 PDF膜ではなくニトロセルロース膜の方がWBに好ましいタンパクも有ります。 WBではなくサンドイッチELISAが良いかもしれません（定量性も期待できる）。

WBにおけるＡβの検出について 削除/引用 No.6076-1 - 2017/06/27 (火) 16:15:29 - ぽん はじめまして。ウエスタンブロット初心者です。 現在インビトロでＮ２ａにＳｗｅｄｅｎ変異型ＡＰＰを導入させた細胞株を用いてアミロイドβの検出を試みています。 細胞を培養した上清をトリシンＳＤＳページで分離し、アンチヒューマンアミロイドβ抗体（82Ｅ1）を一次抗体としてウェスタンブロットを行っていますが思ったように4.4ｋＤａの所にバンドが現れません。 何かアドバイスなどある方、ご助言お願いします。

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