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(無題) 削除/引用 No.6139-5 - 2017/07/21 (金) 09:36:28 - toto 極端なサイレンシングが起きてるのですね。以前、RNAの安定性に関係する因子をやっていた場合、似たようなことが起きたような記憶があります。こういう場合は、割り切って、MEFと同じで、取れたときに一気に増やしてストックして、2週間くらいで使い切るのが再現性のためにはいいのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6139-4 - 2017/07/21 (金) 04:27:20 - とも なな氏さん、おおさん、 返信ありがとうございます。 私たちもサイレンシングだろうと思っているのですが、それにしてはあまりに急速に、再現よく発現量が下がるので驚いています。 今まで別のクローンではこのようなことがなかっただけに対処に困っています。 このクローンでは、発現システムを変えるわけにもいかなくて、またある実験では長期間の培養が必要なため、それでも困っています。 sodium butyrateは一つの候補として挙がっています。 試しにちょっと使ってみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.6139-3 - 2017/07/20 (木) 06:39:43 - おお おそらくメチル化でしょうけど、他のメカニズムも関与しているかもしれません。発現量が継代ごとに減っていくことは導入したものによってはまあまああることかと思います。なのであるていど継代しながら増やして、そこでストックをつくり、ストックから起こしたものを何代以内で使うとかそういうふうにするのはあり得る方法です。 また、テトラサイクリンなどで誘導できる系に切り替えるかでしょう。 薬剤マーカーによってはTransfection後に薬剤で２４時間処理して、プラスミドが入っている細胞を濃縮してそのご薬剤なしで実験するなど、Transientで確実に導入された細胞だけを濃縮するような方法もあります。 発現をもとに戻すことはあまり考えないほうがいいかと、、、メチル化阻害剤などあるにはありますけど、、、

(無題) 削除/引用 No.6139-2 - 2017/07/20 (木) 06:22:10 - なな氏 一つの可能性は、いわゆるsilencingというヤツです。 CMVプロモーターはsilencing され易いことで有名なので、されにくいプロモーターを使うか、酪酸ナトリウム（sodium butyrate）などでHDAC阻害をすれば一時的にsilencingを解除して発現をあげることができます。 　 もう一つは、発現が高いものが細胞増殖に不利で、死んだり増殖が遅いために淘汰されている可能性ですが、この場合はselection試薬を長期間入れたり、サブクローニングしたりするのが良いかと思います。

安定発現株の発現低下 削除/引用 No.6139-1 - 2017/07/20 (木) 02:16:14 - とも 質問させてください。 今ラボでCHOの安定発現株を持っているのですが、日を追うごとに発現が落ちる現象がみられています。 だいたい30日ぐらいの培養で、元の発現の1/10以下になってしまいます。 薬剤は常に加えた状態で培養しているため、ラボではどうもサイレンスが起こってると疑っています。 このようなことは頻繁に起こるのでしょうか？ サイレンスで1/10以下にまで劇的に発現が落ちるか知りたいです。 また、これが本当にメチル化だとすると、どうすれば発現をもとに戻すことができるのでしょうか？ どなたか教えてください。 よろしくお願いします。

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