いつも勉強させてもらっています。
ある膜タンパクが細胞の状態によって細胞内部から細胞膜に移行するのを捉えるためにflag tagを細胞外ドメインのなかに組み込んで抗体で検出することを考えています。
細胞外ドメインを認識する抗体があれば簡単なのですが、まず市販の抗体で細胞外ドメインを認識するものが存在しないのと、そのタンパクのファミリーで細胞外ドメインに対する抗体を作成するのがとても困難であることが知られているため、とりあえずの策としてタグ抗体での検出を考えていると言う次第です。
flag tagは一般的にはNまたはC末端に付けるみたいですが、タンパク内部でも問題ないでしょうか？
次のような問題の可能性を予想しております。
１．タグの挿入によってタンパクの局在が変化してしまう。
２．タグの挿入によってタンパクの立体構造、機能が変化してしまう。
３．内部に挿入したタグは抗体によって認識されにくい。
disulfide bondsを予想するプログラムによると、細胞外ドメインのなかに１つC-C bondが形成されているみたいですので、その中に入れるのは避けた方が良さそうです。また細胞膜ドメイン近傍は抗体が近づきにくい気もします。
恐らくケースバイケースということになろうかと思うのですが、どなたか、このような案件にお詳しい先生がおられましたら、どのあたりにタグを入れた方が良いとか、注意点とかを教えて頂けますと助かります。
すいませんがよろしくお願いします。 |
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